蛋白质分子定向进化其他方法

1、蛋白质分子定向进化其他方法 蛋白质分子定向进化其他方法 自然界在长期的进化过程中产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。 自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计（rational design），但蛋白质结构的复杂性极大地增加

2、了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化（molecular directed evolution）策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。 定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性（突变和或重组）；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重

3、复这个过程直到达到目标。该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。 蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。每一步都可以有多种方法。 常见的定向进化方法有：易错pcr技术dna改组技术外显子改组交错延伸重组随机引物体外重组法（rpr）。当然还有其他的方法，下面就来给大家一一介绍。 一、随机诱变 化学诱变剂介导的随机诱变 体外随机诱变也可在65下直接用羟胺处理带有目的基因片段

4、的质粒，然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。 由致突变菌株(mutator strain)产生随机突变 美国stratagene公司构建了一株dna修复途径缺陷的大肠杆菌突变株xll-red，它体内的dna突变率比野生型高五千倍。将带有要突变基因的质粒转化到xll-red菌株内复制过夜，在此过程中会产生随机突变。每两千个碱基中通常约有一个碱基置换。将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中进行筛选。 连续几代的随机突变和筛选的方法是从每一代中挑选出一个最佳的突变体作为下一代的亲本。通过积累氨基酸的正突变，可加快进化的进程。 定点突变和定点饱和突变技术 定点突

5、变技术(sitedirected mutagenesis)一般用于对dna分子特定位点的突变，所以需要预先知道野生型基因序列。早在1978年michael smith就运用寡核苷酸进行定点突变。定点突变的基本原理是首先合成一段含有突变碱基的dna引物，然后这段合成的引物可以杂交到包含有目的基因的单链 dna上，用dna聚合酶将剩余片段进行延伸，得到的双链分子转入到宿主细胞并被克隆，最后用特定的筛选方法将突变子筛选出来。定点突变技术有盒式诱变和多种基于pcr的突变方法，最常见的有重叠pcr等方法。当靶位点氨基酸分别可被其它19种氨基酸代替而得到突变子的方法，称为定点饱和突变技术，此方法是要着重寻

6、求靶位点的最适氨基酸。定点突变和定点饱和突变技术的运用，能极大地丰富突变体库的多样性。 组合活性中心饱和突变试验 组合活性中心饱和试验(combinatorial activesite saturation test，cast)的基本原理是：在酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位点，选择的氨基酸对必须是在侧链基团取向上具有潜在的协同作用。因此，突变后才可能获得更具有潜力的突变体。这是单点突变不能做到的。如果选择的氨基酸对应的位置是n，则第2个氨基酸的选择遵循以下的原则：如果第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第n+1位；若在折叠上则选择第n+2位，若在310螺旋

7、上，则选择第n+3位；若在螺旋上，则选择第n+4位。对于cast突变体库容量的计算：每突变一对氨基酸要进行饱和随机突变，即这一对氨基酸要突变成xxxx年来还发展出了更多的、新颖的无性突变技术。例如，三核苷酸突变(trinex)，随机插入-删除突变(rid)，序列饱和突变(sesam)以及它的改进方法sesamtv+。这些方法都是为了能最大程度的增强突变体库的多样性，丰富并延伸无性突变的方法手段。 二、基因体外重组 限制性酶切-再连接介导的基因重组(recombining the genes by restriction and religation) 利用限制性内切酶对欲重组的两个以上dna序

8、列进行酶切，然后在连接酶的作用下随机重新连接起来，可实现dna分子问的重组。实验证明，简单的酶切-再连接可进一步提高对硝基苯酯酶的活性。但如果两个正突变处于同一段限制性酶切片段上，则无法将它们重组于同一序列中。 基因家族改组 在基因改组的基础上，1998年由crameri等提出了基因家族改组技术(dna family shuffling)，至此才是真正的有性重组的开始。基因家族改组与单基因改组最大的区别在于出发序列的同源性。利用基因家族同源序列进行dna改组，实现同源重组。由于同源序列是经过自然选择保留下来的相对有益或无害的片段，所以基因家族改组的突变机率和改组效率明显提高，体现了基因的多样性

9、。 过渡模板随机嵌合生长 过渡模板随机嵌合生长（random chimeragenesis on transient templates，rachitt）技术是与dna shuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术。它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时dna模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接（图2）。其中的悬垂切割步骤使短片段（比dnase消化片段还短）得以重组，明显提高了重组频率；如果在片段重组前后采用错误倾向pcr还可引入额外点突变。coco等首次报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶，产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉，重组水平比dna shuffling类方法（14个交叉）高出 几倍；并且可在短至5bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是dna shuffling所难以达到的。 酵母增强组合文库 酵母增强组合文库（combinatorial libraries enhanced by recombination in yeast，clery）是一个真核基因家族shuffling策略。其原理是将体外dna shuffling程序与接下来的酵母体内重组缔合起来，构建高丰度低亲本水平的重组文库：直接以含目的基因的质粒作为体外shuffling的模板；shuffling后基因产物与线性化的酵母表达载体共转化酵