荧光定量PCR实验指南

1、荧光定量pcr实验指南 荧光定量pcr实验指南 第一部分 一、 基本步骤： 1、目的基因（dna和mrna）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、 目的基因（dna和mrna）的查找和比对； 从/点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开dnas

2、tar软件中的editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用dnastar软件中的editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用dnastar软件中的seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add” 或“add all”，然后点击“done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线

3、的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project” 菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现

4、重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、 引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是pcr中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 2序列选取应在基因的保守区段； 2扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green i技术对片段长度没有特殊要求；

5、taqman探针技术要求片段长度在50bp150bp； 2避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 2避免引物自身形成环状发卡结构； 2典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非 目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。tm值在5565，gc含量在40%60%； 2引物之间的tm相差避免超过2； 2引物的3端避免使用碱基a； 2引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。 2为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

6、2.2 taqman 探针设计 一般设计原则： 2探针位置尽可能地靠近上游引物； 2探针长度通常在2535bp，tm值在6570，通常比引物tm高510，gc含量在40%70%。 2探针的5端应避免使用碱基g。 2整条探针中，碱基c的含量要明显高于g的含量。 2为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。(/blast) 2.3 taqman mgb 探针设计介绍 mgb探针的优点： 2mgb探针较短(14-xxxx年，在室温（15到30）最多可以保存2个月。 探针即寡核苷酸进行荧光基

7、团的标记，标记本身有效率的区别。探针标记以后一般应该纯化，纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，且保存时间可以高达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。 由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2um（10），作为工作浓度分装多支，避光保存。 3.4 热启动 热启动pcr是除了好的引物设计之外，提高pcr特异性最重要的方法之一。尽管taq dna聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行pcr反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计

8、的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于dna工程的遗传元件的构建和操作，热启动pcr尤为有效。 限制taq dna聚合酶活性的常用方法是在冰上配制pcr反应液，并将其置于预热的pcr仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟dna合成，直到pcr仪达到变性温度。包括延缓加入taq dna聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出

9、来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 transitor? hot start taq酶对于自动热启动pcr来说高效可靠。transitor? hot start taq是在常规taq酶的基础上进行了化学修饰，使得该酶在低温或常温下没有酶活，因此在加样至pcr扩增前，不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增。高温条件下，化学修饰集团会被剪切，从而释放酶活。此外，随着pcr扩增的进行，酶活会被逐步释放，有效提高扩增效率及产物量。transitor? hot start taq dna聚合酶在变性步骤的95保温过程中要持续20分钟才会被释放

10、到反应中，从而完全恢复聚合酶活性。 3.5镁离子浓度 镁离子影响pcr的多个方面，如dna聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dntp和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200m dntp的实时定量pcr，使用3到5mm带有荧光探针的镁离子溶液（普通pcr是1.5mm）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通pcr从1mm到3mm，以0.5mm递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用 transitor? hot start ta

11、q酶。transitor? hot start taq dna聚合酶能够在比一般的taq dna聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。 3.6 模板质量 模板的质量会影响产量。dna样品中发现有多种污染物会抑制pcr。一些在标准基因组dna制备中使用的试剂，如sds，在浓度低至0.01时就会抑制扩增反应。分离基因组dna较新的方法包括了dnazol，一种胍去垢剂裂解液，以及fta gene guard system，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存dna。应注意进行pcr 反应的模板质量，以增加pcr 反应的成功率。 3.7 模板浓度 起始模板的量对于获得高

12、产量很重要。对大多数pcr扩增和荧光pcr扩增，104到106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到1g的人类基因组dna，相当于3104到3105个分子，足以检测到单拷贝基因的pcr产物。质粒dna比较小，因此加入到pcr中的dna的量是pg级的。对于一般的检测样品，10100ng的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于定量pcr而言是非常容易，且能分析扩增效率。 表1. 基因组大小和分子数目的比例 基因组 dna e. coli saccharomyces cerevisiae arab

13、idopsis thaliana drosophila melanogaster homo sapiens xenopus laevis 1.0mus musculus zea mays puc 18 plasmid dna target size(bp)* molecules/g genomic dna 4.7106 2.0107 7.0107 1.6108 2.8109 2.9109 3.3109 1.51010 2.69103 1.8108 4.5107 1.3107 6.6105 3.2105 3.1105 2.7105 6.0104 3.41011 amount of dna(g)

14、of for -10 molecules 0.001 0.01 0.01 0.5 1.0 1.0 1.0 2.0 110-6 3.8 防止残余（carry-over）污染 pcr易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源dna污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的dna或克隆的dna也会是污染源（非残余污染）。 可以在pcr过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用带滤芯的移液管可以阻止气雾剂进入eppendorf管内。为pcr样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。 使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。 一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶dna糖基化酶（udg）。这种酶（也称为尿嘧啶-n-糖基化酶或ung）移除dna中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板dna区分开来。因为前面的扩增产物对udg敏感，所有可以在pcr前对新配制的反应用udg处理以破坏残余产物。 第二部分 1、 高产量，特异和灵活的定量pcr试剂体系 影响pcr的因素如此之多，您有时很难区分是什么导致您的实验结果不佳。降低实验的不稳定因素是使用优质可靠的产品。 使用优质、性能可靠的热启动