抗狂犬病单克隆抗体调研报告1

1、抗狂犬病单克隆抗体调研报告 who建议， iii类暴露以及野生动物咬伤的ii类以上的暴露，应同时进行主动和被动免疫治疗，以获得快速的保护作用。（主动免疫即注射狂犬病疫苗，被动免疫即注射狂犬病中和抗体）1.被动免疫原理通过局部应用直接中和伤口处理时残留的病毒，这样最大程度降低伤口处病毒的含量，来降低发病率及延长潜伏期。一般情况下初次接种狂犬病疫苗后，体内产生的狂犬病病毒中和抗体自第七天开始达到可检测水平，1014天体内抗体滴度达到保护性水平。因此，疫苗接种的早期，体内尚未产生足够滴度的中和抗体。而狂犬病被动免疫制剂注射后能够立即中和大部分伤口局部的病毒，阻止病毒扩散并侵入神经系统。狂犬病被动免疫

2、制剂的半衰期为1421天，可为疫苗诱发主动免疫赢得时间。因此，狂犬病被动免疫制剂和疫苗联合使用，可以最大限度地防止狂犬病的发生。2 狂犬病被动免疫制剂目前用于狂犬病被动免疫治疗的制剂主要有马抗狂犬病病毒免疫球蛋白(equinerabiesimmune globulin，erig)和人抗狂犬病病毒免疫球蛋白(human rabies inlmune globulin，hrig)。这两种生物制剂均为为抗r v多克隆免疫球蛋白 ，主要通过主动免疫人或马的外周血中分离提纯而得, 即人源或马源抗rv多克隆免疫球蛋白,含有抗 rv 糖蛋白( gp)、核蛋白 (n p) 等多种成分的抗体，多克隆免疫球蛋白主

3、要通过饱和式结合r v-gp多表位而使病毒失活。目前我国用于狂犬病预防的被动免疫生物制剂有两种：人源抗狂犬病免疫球蛋白(hrig)和马抗狂犬病血清。经检索，我国用于狂犬病预防的被动免疫生物制剂均为国产，未见进口。两种制剂国内上市及申报情况见附表1-4。两种狂犬病被动免疫制剂的优缺点狂犬病人免疫球蛋白（hrig）马抗狂犬病血清（erig）理论上存在感染hiv/hcv的危险不存在感染hiv/hcv的危险免疫用制备疫苗要求高，价格高制备抗原容易且价格较低来源受限供应量保证存在伦理道德问题不存在伦理道德问题 异源性小有异源性几乎无不良反应接种不良反应发生率高较为安全部需做皮试有过敏风险,必须做皮试半衰

4、期为21天左右半衰期为14天左右由 于 erig 副反应比较严重， 而且对某些疫苗的抗体反应有抑制， 而 hrig价格昂贵，供应量有限并且有潜在的病原威胁。回顾免疫失败的病例，分析原因除了个别批号质量有问题外，与未联合使用狂犬病人免疫球蛋白（hrig）和未正确使用这免疫抑制剂有关。我国狂犬病被动免疫制剂无论产量还是质量上都不能满足国内市场的需求，因此制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂是亟待解决的问题。3. 治疗性狂犬病单克隆抗体（m ab）kohler等于1975年创淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体(monoclonal antibodies，mcab)技术给抗体技术的研究和应用带来了大突破。mc

5、ab技术建立30年来发展迅速，在临床诊断、治疗、预防以及基础研究中的应用日益广泛，其中治疗性mcab的研究更为深入。应用特异性的mcab防治狂犬病可以克服多抗血清的诸多缺点，同时具有安全性好、特异性强、用量小、成本低、可大量生产等优点，效果与hrig近似，适合用于暴露后治疗，临床应用前景广阔。3.1鼠源性狂犬病治疗性单克隆抗体1989年，schumacherl等制备了多株针对rv糖蛋白、核蛋白的鼠源mcabs，这些用称之为鸡尾酒单克隆抗体疗法(cocktail ofantirabies monoclonal antibodies，mcabc)，对小鼠及地鼠的保护性实验表明：该方法不仅具有被动免

6、疫后完全抵抗致死剂量rv的攻击的能力，还具有暴露后保护作用。1990年，dietzschold等制备了能够识别rv糖蛋白、核蛋白、基质蛋白特异原决定簇的mcabs，经动物攻毒试验证明，只有针对糖蛋白的mcab具有中和病毒、保护受试动物抵抗致死量病毒攻击的活性。该研究也证明了糖蛋白是抗rv主要(甚至是唯一)的中和性抗原蛋白为其后以糖蛋白作为主要目的蛋白制备各种新型疫苗以及抗体用于狂犬病的防制奠定了基础。2007年muhamuda等获得多株针对狂犬病病毒糖蛋白(glycoprotein，g)的鼠源单克隆抗体，并在动物模型上验证其暴露后预防狂犬病的效果。结果表明其中和效价在165075，000 iu

7、ml之间，可以保护70100的实验小鼠和豚鼠免受致死剂量的狂犬病毒攻击，在中和滴度以及蛋白浓度活性上高于市场上erig 2,000倍，希望进一步研究应用于人暴露后预防。3.2人源化狂犬病治疗性单克隆抗体异源mcab在体内很快即被清除，且易产生类似血清病的超敏反应，限制了其在临床上的应用。应用人源化单克隆抗体(human monoclonal antibodies，humcabs)副反应小，亲和力大，作用确定和安全，而且，可以将mcabs联合使用以增加其保护力和抗病毒范围，更有可能应于临床治疗，显示出极好的应用前景。狂犬病治疗性humcabs的研究目前已很成熟。1990年bernhard die

8、tzschold等利用细胞融合技术 制备了多株人源抗狂犬病毒单克隆抗体1 其中mab57表现出对狂犬病毒糖蛋白较高的亲和力可广泛中和狂犬病毒 并对狂犬病毒攻击的小鼠起到保护作用在获得抗狂犬病毒抗体基因后使得利用生物反应器来制备人源抗狂犬病毒单克隆抗体成为可能。2001年bernhard dietzschold研究小组将mab57基因导入spbn病毒表达系统在bsr细胞中制备了具有生物学活性的so57单克隆抗体，但是该方法操作复杂稳定性较差无法真正实现产业化 。2003年, hilary koprowski 研究小组将编码so57单克隆抗体的基因导入烟草中利用烟草表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体。体

9、外中和实验发现 烟草中产生的抗体对几种狂犬病病毒的抑制作用与人类的抗狂犬病毒抗体效果相当后来他们又尝试用烟草悬浮细胞生产人源抗狂犬病毒单克隆抗体 依然获得了有生物学活性的抗体。 但是上述2种制备人源抗狂犬病毒单克隆抗体的方法 均由于烟草中外源蛋白产量较低至今仍然没有实现产业化pros等对防制狂犬病的鸡尾酒疗法(mcabc)做了更加深入地研究，他们使用基因重组技术，构建弹状病毒载体，表达了3株不同型以及针对不同抗原表位的人源抗rv中和性mcabs，将这些humcab混合在一起使用，在bhk和cho细胞上以及小鼠攻毒试验中证明：只需一次量就能够保护致死量的rv对细胞的感染以及对小鼠的攻击，其效果与

10、hrig近似，在成本和安全性等方面则优于hrig，用于暴露后预防狂犬病的发生很有前途。2005年以来，goudsmit等和bakker研究小组先通过体外和体内中和效价试验以及宽中和波谱试验鉴定出一株高中和活性、高亲和性、宽中和波谱并且对各型毒株均有作用和逃逸突变体的mcabcr57，然后通过噬菌体展示技术又筛选到一株同样优秀而又有互补作用的mcabcr4098。直接混合使用这两株mcabs，并与hrig进行比较，结果表明，mcabs与hrig在暴露后预防中的相仿，且与多株rv有良好的交叉反应性，证明了重组人源化抗rv mcabs的实际可用性，甚至可以替代rig。2008年bakker又报告，该

11、研究小组使用cll84单克隆抗体鸡尾酒疗法在美国和印度已完成一期临床实验，结果表明，所有试验对象使用一个剂量的cll84(20iukg)后，从第l天到第14天均能在体内检测到具有保护效价(051uml)的狂犬病病毒中和活性抗体的存在，而直到2l天都能检测到抗体的存在。并且该临床试验时未发现任何副作用，cll84安全有效，临床上可代替rig用暴露后预防。3.3狂犬病治疗性单克隆抗体的大规模生产与狂犬病治疗性单克隆抗体发展同步，利用动物细胞以及转基因植物等大规模生产抗rv单克隆抗体以及多克隆抗体的研究也有许多。2001年，morimot等使用水泡性口炎病毒的糖蛋白基因换rv的糖蛋白基因，并且插入编

12、码人源meab的重链和轻链基因，从而改造rv疫苗株，并以此改造病毒作为载体，高效表达(约60pgcell)抗rv的中和性humcabs。该重组病毒可以感染多种胞系并且没有溶细胞作用，常规细胞培养技术就可以大量生产。通过转基因植物也可大量生产重组抗rv meabs，重组meab在植物体内可以被正确的表达、装配以及糖基化。yoram通过土壤杆菌属介导的转基因植物，将抗rv mcab的重链(heavy chain，hc)融合在细胞内质网记忆信号lysaspglu，获得了可以表达抗rv mcab的转移因植物。这些研究可以很好地解决使用hrig等抗血清防制狂犬病的高成本问题。此外，motoi等人的一项研

13、究在大量生产抗体方面做出了新的尝试，他们通过大肠杆菌表达部分rv糖蛋白，免疫产蛋母鸡，取得所产鸡蛋，然后纯化卵黄，获得免疫球蛋白igy。并通过进一步实验证明该抗体在体外可以特异性的束缚病毒感染细胞，甚至可以中和rv的感染力。小鼠保护性实验效果也很不错，有望替代人源或马源rig用于防治狂犬病。4.目前治疗性狂犬病单克隆抗体上市销售及注册申报情况经检索，目前国内外没有治疗性狂犬病单克隆抗体的上市销售。国内外在研的治疗性狂犬病单克隆抗体都是特异性结合狂犬病毒g蛋白的单克隆抗体（抗rv-gp m ab）。4.1国内治疗性狂犬病单克隆抗体国内治疗性狂犬病单克隆抗体注册申报情况经检索，2009年，华北制药

14、新药研发中心自主研发的重组人源抗狂犬病毒单抗注射液获国家食品药品监督管理局新药人体临床试验批件，成为我国第一个具有自主知识产权的重组人源抗体的临床试验批件。目前已完成一期临床，即将启动二期临床。bernhard dietzschold利用细胞融合技术制备了多株人抗狂犬病单克隆抗体，能特异性结合狂犬病g蛋白的一株抗体mab57能够高效广泛中和狂犬病毒并且对狂犬病攻击的实验动物起到保护作用。该研究小组将mab57基因导入spbn病毒表达系统在bsr细胞中制备了具有生物学活性的so57单克隆抗体，但是该方法操作复杂稳定性较差无法真正实现产业化 。华北制药开发了能够产业化生产狂犬病单克隆抗体s057的

15、制备工艺，将s057基因在cho细胞中表达，构建了高效表达so57的工程细胞，将其得到的抗体命名为nm57。通过该法so57的表达量大100毫克/升，抗体均一稳定性好。so57抗体重链的氨基酸序列为：so57抗体轻链的氨基酸序列为：4.2国外治疗性狂犬病单克隆抗体荷兰crucell公司、美国mds公司、印度relclin公司等单位的合作者在2008年11月5日出版的vaccine杂志上报告了抗狂犬病毒单克隆抗体鸡尾酒cl184 首次用于人类的两组i期临床研究资料。人单克隆抗体鸡尾酒cl184包含两种单抗：cr57和cr4098（均为igg1）。这两种单抗都是在人源per.c6细胞系中产生，直接

16、针对狂犬病毒非重迭的不同抗原表位，在与狂犬病毒的糖蛋白结合时相互无竞争作用。cl184有希望作为狂犬病免疫球蛋白(rig) 的一种替代品用于狂犬病的暴露后治疗。经ncbi检索未查找到cr57和cr4098重链和轻链氨基酸序列。4.3单克隆抗体（mab）在狂犬病治疗中存在的问题mab难以应对病毒多样而复杂的变异, 即使多mab混合使用或者多克隆免疫球蛋白在某些人为因素面前也面临着挑战。rv除了基因复制过程中的错误和紫外线照射发生变异外, 还可通过不同毒株间同源重组而产生新的变异株。显然无论rv自然变异,还是人为性突变, mab 在未来的狂犬病预防中都表现出滞后性。随着分子生物学的发展, 通过基因

17、突变技 术提前预测可能的变异, 制备相应分子模式的mab可防患于未然。4.3.1 r v隐匿性侵袭及血脑屏障作用在侵入神经元细胞前期,rv 表现出隐匿性入侵特征, 如低rna 复制, 低rv-gp 抗原表达以逃避机体免疫系统的攻击, 此时无明显症状, 多疏于防范。一旦 rv 侵 入神经元细胞,便在很短的时间进入中枢神经系统, 此时患者也逐渐表现出各种特征性的临床症状, 血清内 rv抗体水平逐渐升高, 但不能中和中枢神经 系统 内的病毒, 其原因是血脑屏障( b lood-brain barrier, bbb) 的作用使抗体等免疫性因子无法进入中枢神经系统发挥作用。4.3.2 mab 难以中和细

18、胞内 rv 在机体抗病毒免疫过程中, 体液免疫主要清除细胞外的病毒, 细胞免疫用于清除病毒感 染细胞, 因 此 m a b 对狂犬病 患者 的治疗作用还很有限, 但过多的细胞免疫成分进入 中枢神经系统会引起神经元细胞死亡,。如何清除病毒的同时尽量维持中枢神经 系统的完整性, 也是狂犬病治疗中的难点之一。4.3.3 rv 致病的多因素性 狂犬病的高致死率, 还与病毒基因组表达的磷蛋白 (p p )、基质蛋白 (m p)有关。r v-pp 是病毒rna 多 聚酶的辅因子, 参与病 毒rna复制, 辅助rna与np组装成核衣壳, 并且在 rv 的逆 神经轴突播散中发挥一定作 。最近研究发现, rv-pp 可以通过 信号转导与转录 激活因子s tat1、stat2 结合抑制干扰素介导的jak / stat 信号途径,或通过抑制干扰素调节因子3活性降低干扰素的 诱导表达,并影响jak / stat 信号途径, 藉此病毒可以抑制感染细胞凋亡并存活于细胞内。r v -m p 也参与病毒的组装, 并且影响病毒从胞内释放。f ink e等将弱毒株欧洲蝙蝠源r