第三部分 酶学相关实验技术

1、温度、pH等对酶促反应速度的影响 一.实验目的 了解温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。二.实验原理 温度与酶促反应速度关系密切。温度降低时，酶促反应速度降低以至完全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到最大值，此温度称酶作用的最适温度。温度继续升高，反应速度反而下降。人体内大多数酶的最适温度在37左右。 PH值影响酶促反应速度，是由于酶本身是蛋白质。PH不仅影响酶蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pH。不同的酶最适pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如唾

2、液淀粉酶的最适pH值为6.8。 凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激动剂。例如Cl-是唾液淀粉酶的激动剂。 凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为酶的抑制剂。例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。三.试剂器材试剂 0.5淀粉液 0.5NaCl溶液 不同pH值缓冲溶液的配制:1/15mol/L KH2PO4液：称取纯KH2PO4 9.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。1/15mol/L Na2HPO4 液：称取Na2HPO4 2H2O 11.815g，加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH5.

3、06.68.01/15mol/L KH2PO49.95.00.11/15mol/L Na2HPO40.15.00.9 1CuSO4溶液器材 水浴锅、电驴、比色盘、试管 吸管、烧杯三.实验方法及步骤制备稀唾液：用清水漱口，含蒸馏水少许，咀嚼以刺激唾液分泌。在小漏斗中垫入一块薄薄的脱脂棉，直接将唾液吐入漏斗过滤。取过滤的唾液2ml加蒸馏水18ml混匀备用。（一） 温度对酶促反应速度的影响 1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5淀粉溶液303030PH 6.6缓冲液101010现象颜色变化 2.混匀后，将1号、2号、3号试管分别置于沸水浴、温水浴（3740）和冰

4、水浴中5分钟，此间振荡之，使温度达到平衡。然后向各试管中加入稀唾液1ml混匀，15分钟后取出，并向各试管加碘液1滴，观察颜色变化并予以分析。（二）pH对酶促反应速度的影响 1. 取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5淀粉液303030PH 5.0缓冲液10PH 6.6缓冲液10PH 8.0缓冲液10稀唾液101010 2. 混匀后，将各管置于温水浴（3740）中保温，此间每隔1分钟从第二管中取反应液1滴与碘混合观察颜色变化并记录。待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化时，向各试管加碘液1滴，观察颜色并解释结果。（三）激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响 1. 取试管

5、3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5 淀粉液202020PH 6.6缓冲液101010蒸馏水100.5 NaCl溶液100.5 CuSO4溶液10稀唾液1010102. 混匀后，将各管置于温水浴（3740）中保温，每隔1分钟在比色盘上用碘检查第二管，待碘不变色时，冷却后分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释结果。试剂 0.5淀粉液 0.5NaCl溶液 不同pH值缓冲溶液的配制:1/15mol/L KH2PO4液：称取纯KH2PO4 9.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。1/15mol/L Na2HPO4 液：称取Na2HPO4 2H2O 11.815g，加蒸馏

6、水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH5.06.68.01/15mol/L KH2PO49.95.00.11/15mol/L Na2HPO40.15.00.9 1CuSO4溶液琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察一.实验目的 通过实验进一步加深对竞争性抑制作用的理解。二.实验原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在无氧条件下，从琥珀酸脱下的氢可由甲烯蓝（蓝色）接受，甲烯

7、蓝被还原成甲烯白。因此，可从加入的甲烯蓝的褪色情况来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的影响。丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。三.试 剂与器材试 剂 0.2 mol/L琥珀酸0.2 mol/L丙二酸0.02mol/L丙二酸以上四种溶液均先用5mol/L NaOH调节至pH 7，再用0.01mol/L NaOH调节至pH 7.4。1/15 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液：量取1/15 mol/L Na2HPO4溶液80.8 ml与1/15 mol/L KH2PO4溶液19.2 ml混合

8、即成。0.02甲烯蓝。液体石蜡。器材 水浴锅、小烧杯、试管、漏斗 四.实验方法及步骤 1.组织提取液（琥珀酸脱氢酶）的制备：取新鲜肝或肌肉组织3g，用蒸馏水冲洗，剪成小块，将组织碎块置于研钵加pH7.4磷酸缓冲液34ml及细砂研成匀浆，然后加1/15 mol/L pH7.4磷酸缓冲液67ml,混匀，用双层纱布过滤，滤液即为组织提取液。2.取干净试管4支，标号后按下表操作： 试管号试剂（滴）1234组织提取液10 10100.2 mol/L琥珀酸44440.2 mol/L丙二酸40.02mol/L丙二酸4蒸馏水4140.02甲烯蓝2222记录颜色变化3.将上述各管摇匀，在液面上滴加液体石蜡10滴

9、以隔绝空气，然后置于37水浴中保温10分钟，观察各管甲烯蓝褪色情况，比较哪一管快（记录所需时间）而且比较彻底，并予以解释。各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约510滴）。为什么？ 4各管置于37水浴中，半小时内观察各管颜色变化，比较其速度并说明原因。然后将第1管用力摇动，观察其有何变化？为什么？米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定 原理在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）

10、。底物浓度SVmaxV底物浓度对反应速度的影响底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：式中v反应速度；Km米氏常数；Vmax酶反应最大速度；S 底物浓度。从米氏方程式可见：米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。测定Km、Vmax，一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是Line

11、waver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/S作图，可得到一条直线。直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。 方法和步骤1、制作标准曲线取9支试管，按08编号。18号管分别加入0.1至0.8mL酚标准应用液，并用蒸馏水将各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。各管各加1mol/L碳酸钠溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，摇匀后，35保温显色10分钟。以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A680。整个操作过程见下表：管号123456780酚含量/mol0.040.080.1

12、20.160.200.240.280.32-0.4mmol/L酚标准应用液/mL0.10.20.30.40.50.60.70.8-蒸馏水/ mL0.90.80.70.60.50.40.30.21.01mol/L碳酸钠溶液/ mL222222222Folin-酚稀溶液/mL0.50.50.50.50.50.50.50.50.5以酚含量(mol)为横座标，以A680为纵坐标，绘制标准曲线。2、测定Km、Vmax取试管7支，按照06编号，空白管为0号。各管按下表加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)，并分别补充0.2mol/L pH5.6乙酸盐缓冲液至0.5mL。35预热2min后，

13、逐管记时加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，摇匀，精确反应15min。各管反应时间到达后立即加入1mol/L碳酸钠溶液2mL，摇匀，再加入Folin-酚稀溶掖0.5 mL，35保温显色l 0min。0号管内最后加入0.5 mL酶液，其它操作与上述各管相同。冷却后以0号管作空白，在可见光型分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A680。在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。管号12345

14、60磷酸苯二钠终浓度/ mmolL-10.50.751.01.251.502.505 mmol/L磷酸苯二钠/ mL0.100.150.200.250.300.500.50.2mmol/L乙酸盐缓冲液/ mL0.40.350.300.250.2000稀释酶液/ mL0.50.50.50.50.50.50.5 (最后加入)1mol/L碳酸钠溶液/ mL2222222Folin-酚稀溶液/mL0.50.50.50.50.50.50.5A680 结果与计算1、从酚标准曲线上查出各管A680相当的酚含量，计算各种底物浓度下的反应初速度v。2、以1/v为纵坐标，1/S为横坐标作图，求出Km和Vmax。碱

15、性砱酸酶Km数值的测定 一.实验目的 通过碱性磷酸酶掌握一般酶Km值的测定原理和方法。二.实验原理 当温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应初速度与底物浓度的关系可用米曼（Miechaelis-Menten）氏方程式表示，km值是反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度，但由于用v与S作图法求Km不方便，所以常用由米曼氏方程式推导出的林贝（Lineweaver-Burk）氏方程式，即1/V与1/S的直线关系作图，求出Km值。 本实验以碱性磷酸酶为例，学习一般的Km测定方法。 碱性磷酸酶是一组酶，能水解多种磷酸脂，如磷酸苯二钠、3-磷酸甘油等，其最适pH为10左右。本实验以磷酸苯二钠作为底物，

16、反应式为： C6H5O-PO3Na2 + H2O C6H5OH + Na2HPO4 反应产生的酚使酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原生成钼蓝及钨蓝，测其吸光度值。以吸光度代表反应速度，用吸光度的倒数与底物浓度的倒数按林-贝氏作图法，在横轴上的截距求Km值。三、试剂与器材试剂 1mol/L磷酸苯二钠：称取127mg磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解并稀释至500ml，加2ml氯仿防腐，置棕色瓶中放冰箱保存，可用一周。 1mol/L乙醇胺缓冲液（pH10.1）：称取乙醇胺（NH2CH2CH2OH）61.1g加蒸馏水800ml，0.3ml/L氯化镁1.0ml，5吐温8020ml，混匀后用浓盐酸校正pH至

17、10.10.05,再加水至1000ml。 碱性磷酸酶(0.1mg/ml)：取纯化碱性磷酸酶试剂10mg，加pH10乙醇胺缓冲液至100ml。 酚试剂：于1500ml圆底烧瓶内加入钨酸钠（Na2WO42H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO42H2O）25g、蒸馏水700ml、85磷酸50ml及浓盐酸100ml。装接冷凝器于瓶上，慢慢加热回流10小时。再加Li2SO42H2O 150g及蒸馏水50ml，必要时过滤。如显绿色，可加溴水数滴使其氧化呈淡黄色。然后煮沸除去过剩的溴，待冷却后稀释至1000ml，此为贮存液，贮于棕色瓶中，使用时加等量蒸馏水稀释之。 7.5Na2CO3：称取无水碳酸钠75g

18、加蒸馏水溶解并稀释至1000ml。器材试管、水浴锅、分光光度计三.实验方法及步骤 1.取大试管6支，按下表进行操作。试管号试剂（ml）1234561mol/L磷酸苯二钠00.10.150.20.40.6蒸馏水1.00.90.850.80.60.41mol/L乙醇胺缓冲液0.50.50.50.50.50.5充分混匀，置37水浴预热10分钟碱性磷酸酶（37预温）*0.50.50.50.50.50.5加酶后立即混匀，置37水浴准确保温15分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.57.5Na2CO34.04.04.04.04.04.0充分混匀，置37水浴保温20分钟取出，离心（2500转/分）10

19、分钟。取上清液，选用650nm的单色光，用1号管调零，测定其它5管的吸光度A.2.以底物浓度S为横轴，各管吸光度值A（代表反应速度V）为纵轴作图，观察曲线形状。并以底物浓度S的倒数（1/S）为横坐标，吸光度A的倒数（1/A）为纵坐标作图，求出碱性磷酸酶的Km值。转氨酶活性的测定实验目的1、熟悉测定转氨酶活性的实验原理及测定意义。2、掌握掌握测定转氨酶活性的测定方法。（一）原理转氨酶是体内重要的一类酶。转氨酶催化氨基酸的氨基与酮酸的酮基之间的相互转化，从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这种作用称为转氨基作用。它在生物体内蛋白质的合成、分解等中间代谢过程中，在糖、脂及蛋白质三大物质代谢的相互联

20、系、相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。在动物机体中活力最强、分布最广的转氨酶有两种：一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称GPT），另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶（简称GOT）。它们的催化反应如下：GOT催化生成的草酰乙酸在柠檬酸苯胺的作用下转变为丙酮酸与二氧化碳。由上可见此反应最终产物都是丙酮酸。测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性。丙酮酸可与2,4 二硝基苯肼反应，形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出其含量，以此测定转氨酶的活性。丙酮酸 + 2,4 二硝基苯肼丙酮酸二硝基苯腙（棕红色）转氨酶的活性单位为：每毫升血清与基质在37下作用6

21、0min，生成1mol丙酮酸为1个单位。（二）试剂1磷酸盐缓冲液（pH7.4）：甲液：1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）9.47g（或Na2HPO412H2O 23.87g）溶于蒸馏水，定容至1 000 ml。乙液：1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.078g，溶于蒸馏水，定容至1 000 ml。取甲液825 ml，乙液175 ml，混合，测其pH为7.4即可使用。2GPT基质液：称取a 酮戊二酸29.2 mg及DL 丙氨酸1.78g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml 中，溶解后再加缓冲液70ml, 并移入100ml容量瓶

22、内。加1mol/L的NaOH溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100ml。贮存于冰箱备用，可用1周。 3GOT基质液：称取a 酮戊二酸29.2 mg及DL 天冬氨酸2.66g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml 中，溶解后再加缓冲液70ml, 并移入100ml容量瓶内。加1mol/L的NaOH溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100ml。贮存于冰箱备用，可用1周。4.2,4 二硝基苯肼溶液：称取2,4 二硝基苯肼20mg，先溶于10ml浓盐酸中（可加热助溶），再以蒸馏水稀释至100ml（有沉渣可过滤），棕色瓶内保存。5丙酮酸标准

23、液（1ml=2mol丙酮酸）：精确称取丙酮酸钠22mg，溶解后转入100ml容量瓶中，用磷酸缓冲液（1/15 mol/L，pH7.4）稀释至刻度。60.4 mol/L氢氧化钠溶液。7血清8柠檬酸苯胺溶液：取柠檬酸50克溶于50ml蒸馏水中，再加苯胺50ml充分混合即成，低温出现结晶时，可置于37水浴中，待溶解后应用。（三）操作1标准曲线制作：取6支试管按下表操作。 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6丙酮酸标准液 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25GPT（GOT）基质液 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25pH7.4磷酸缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.

24、1 0.12，4二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5水浴37，20min0.4mol/L氢氧化钠溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0（ml）相当活性(单位数) 空白 100 200 300 400 500混匀后放置10 min，在520nm波长处，以空白调“0”点，读取各管光密度。以单位值为横座标，光密度为纵座标，绘制标准曲线。2G PT（GOT）测定：取2支洁净的试管按下表操作。试剂 （ml） 空 白 测 定血清 0.1 0.1G PT（GOT）基质液 - 0.5混匀, 37水浴，30minG PT（GOT）基质液 0.5 -柠檬酸苯胺溶液 （滴）

25、1 12,4二硝基苯肼溶液 0.5 0.5混匀, 37水浴，20min0.4mol/L氢氧化钠（ml） 5.0 5.0混匀，放置10min，在波长520nm处测定，以空白调“0”点，读取光密度。GPT测定不加柠檬酸苯胺溶液，其他操作方法同GOT测定法。（四）计算1由所测得之光密度值直接查标准曲线，即可得知活性单位。2若用标准管法测定，可用丙酮酸标准液（1ml = 2mol）0.1ml，按操作测知标准管光密度，按下列方式计算结果： （测定管光密度/标准管光密度）200 = 转氨酶活性 (单位数) / 100ml血清血清谷丙转氨酶的测定一. 实验目的掌握血清谷丙转氨酶的测定方法。二. 实验原理 血

26、清谷丙转氨酶（S、G、P、T）作用于丙氨酸及-酮戊二酸，结果生成谷氨酸与丙酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。 三. 实验方法及步骤 取15150mm中试管 4支，标号，按下表操作:静止10分钟后，选用 520nm 的单色光，以蒸馏水调零，测定各管光密度。 四. 计算 本法所规定的谷丙转氨酶活性单位的定义是：1ml 血清于37 与底物作用30分钟，产生2.5g 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。 正常值：240单位/ ml血清。五. 附注 1. 2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性

27、的，-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而显色。此外，2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白管颜色较深，吸光度常在0.18左右。1. 可用小白鼠肝匀浆（20倍稀释）代替血清进行实验。3. 肝匀浆的制备: 用右手抓住小白鼠的尾巴，令其头朝下，然后迅速置桌上，立即用左手按住鼠的颈子，右手猛拉老鼠尾巴，使颈椎卡断死亡。将肝脏取出，放在滤纸上，用天平称重，放在研钵中，生理盐水 5ml研磨，然后再加生理盐水，配成 1:19（即20倍稀释）的肝匀浆，用双层纱布过滤，收集滤液备用，此液每ml含G.P.T200单位。 注：试剂的配制 （1）M/10磷酸盐缓冲液（PH=7.4）：取磷酸二氢钾 2.69g

28、，磷酸氢二钾 13.97g 加水溶解后移至100ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，贮于冰箱中备用。 （2）底物液（基质液）：取DL-丙氨酸 1.79g，-酮戌二酸 29.2mg，先溶于约 50ml 磷酸缓冲液中，然后以1N NaOH校至 PH=7.4，再以磷酸盐缓冲液稀释到 100ml，加氯仿数滴防腐，贮存冰箱中一般可用一个月（不生混浊，不生霉即可用）。 （3）丙酮酸标准液（100g/ml）：准确称取已干燥至衡重的丙酮酸 12.64 mg，置于 100 ml 容量瓶中， 以 PH=7.4 的磷酸缓冲液稀释到刻度。 此液必须临用前配制，不能存放。 （4） 2.4-二硝基苯肼液（0.02 %）：称取

29、2.4-二硝基苯肼 20 mg，溶于10N HCl 10ml中（或4N HCl 125 ml中），溶解后再加蒸馏水至 100 ml。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力测定（比色法）【实验目的】1、理解乳酸脱氢酶的脱氢原理2、掌握乳酸脱氢酶活力的测定方法步骤。【实验原理】乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。LDH可溶于水或稀盐酸。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH,

30、NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油33磷酸脱氢酶等。本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察 NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25，pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位。试剂和器材试剂 1、50mmol/L pH6.5磷酸氢二钾磷酸二氢钾缓冲液母液：A: 50 mmol/L K2HPO4: 称K2H

31、PO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200mL。B: 50 mmol/L KH2PO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500mL。取溶液A 31.5mL 溶液B 68.5mL, 调节pH至6.5。置4冰箱备用。10mmol/L pH 6.5磷酸氢二钾磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。2、0.2 mol/L pH7.5磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液母液：A: 0.2 mol/L Na2HPO4: 称Na 2HPO412H2O 71.64g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。B: 0.2 mol/L NaH2PO4: 称NaH2PO42H2O 31.21g加蒸馏水溶解后定容至

32、1000mL。取溶液A 84 mL 溶液B 16 mL, 调节pH至7.5。置4冰箱备用。0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。3、NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1mL摇匀。现用现配。4、丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29mL, 使其完全溶解。现用现配。二、材料 兔肉。三、器材组织捣碎机；移液管；微量注射器10l（1）；恒温水浴；分光光度计。操作方法一、制备肌肉匀浆称取20g兔肉, 按W/V=1/4比例加入4预冷的10mmol/L pH 6.5磷酸氢二钾磷酸

33、二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。二、LDH活力测定预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1mol/L pH 7.5磷酸氢二钾磷酸二氢钾缓冲液3mL，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9mL, NADH溶液0.1mL，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10L，立即计时，摇匀后，每隔0.5min 测A340，连续测定3min，以 A对时间作图，取反应最初

34、线性部分，计算每分钟A340减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）应控制每分钟A340下降值在0.10.2之间。三、数据处理计算每毫升组织提取液中LDH活力单位：LDH活力单位（U）/mL 提取液注意事项（1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在20冰箱。（2）酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A340下降值在0.10.2之间，以减少实验误差。（3）NADH溶液应在临用前配制。大麦萌发前后淀粉酶活力的比较【实验目的】【实验原理】 种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在，通过淀粉酶可使淀粉分解为麦芽糖。2（C6H10O5）nnH2OnC12H22O11麦芽糖具有还原性，能还原3，5-

35、二硝基水杨酸成为棕色的3-氨基5-硝基水杨酸，后者用分光光度计法可以定量。 休眠种子的淀粉酶活力很弱，但经吸胀萌发后，淀粉酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增加而增加。本实验通过测定大麦种子萌发前后的淀粉酶活力，来了解此过程中淀粉酶活力的变化。【仪器、试剂和材料】1仪器刻度试管、吸管、研钵、离心管、离心机、分光光度计、恒温水浴锅。2试剂：（1） 0.1%标准麦芽糖溶液20mL：精确称量100mL麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。（2） PH6.9 0.02mol/L磷酸缓冲液100mL：0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mL磷酸氢二钾82.5mL混合，稀

36、释10倍。（3） 1%淀粉溶液100mL：1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氢化钾。（4） 1%3，5-二硝基水杨酸试剂200mL：1g3，5-二硝基水杨酸溶于20mL 2mol/L的氢氧化钠溶液和50mL水中，再加入30g酒石钾酸钠，定容至100mL。若溶液浑浊，可过滤。（5） 1%氯化钠溶液300mL。 3材料：大麦种子、海砂5g。【操作步骤】1种子发芽大麦种子浸泡2.5h后，放入25恒温箱内或室温下发芽。大麦萌发所需要的时间与品种有关。若难以萌发，可适当延长浸泡时间和发芽时间。2酶液提取取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放入钵体内，

37、加海砂200mg，加1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20min，搅拌几次。然后提取液离心（1500r/min）67min。将上清液倒入量筒，测定上清液的总体积。然后将此提取液稀释10倍，进行酶活力测定。 取干燥种子或浸泡2.5h后的种子15粒作为对照，将上述提取步骤进行操作。3酶活力测定取25mL刻度试管4支，编号，按下表要求加入试剂（各试剂需在25预热10min）： 试管标号试剂加入量/ML1 2 3 4干燥种子（或浸泡25H后） 发芽3D或4D幼苗的 标准管 空白管 的酶提取液 酶提取液酶液标准麦芽糖1%淀粉溶液水0.5 0.5 1 1 1 1 0.5将各管混匀放在25水浴中

38、，保温3 min后，立即向各管中加入1%的3，5-二硝基水杨酸溶液2ML。再次放入拂水浴中加热5 min，冷却至室温，加水稀释到25ML，充分混匀。用空白管作对照，在500nm处测定各管的光吸收值。将读数填入下表：试管号 1（干燥种子的酶提取液）2(发芽3、4d后的酶提取液)3(标准)4（空白）A500nm【结果处理】根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即： 则 式中 C浓度； A光吸收值。本实验规定：25时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位，则15株种子或15株幼苗的总活力单位C酶n酶V酶：C酶为酶液的浓度，n酶为酶液稀释倍数，V酶为提取酶液的总体积。胰蛋白酶的制

39、备及活力的测定目的要求（1）学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。（2）了解酶的活性与比活性的概念。实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.68.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物

40、都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键 酰胺键 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-

41、L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶

42、液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过23次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到800010000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。试剂和器材一、试剂1、pH2.5乙酸酸化水；2、2.5mol/L H2SO4；3、5 mol/L NaOH；4、2 mol/L NaOH；5、2mol/L HCl；6、0.001 mol/L HCl；7、硫酸铵；8、氯化钙。9、0.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mo

43、l/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。10、0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用0.8 mol/L稀释1倍即可）；11、0.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。12、0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl 缓冲液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。13、底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 TrisHCl 缓冲液中加0.34毫克BAEE和2.22毫克的氯化钙。二、材料新鲜或冰冻猪

44、胰脏三、仪器食品加工机和高速分散器；研钵；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽滤瓶；纱布；恒温水浴；紫外分光光度计；秒表；pH试纸。操作方法一、猪胰蛋白酶制备（一）猪胰蛋白酶原的提取猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于1015搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.53.0，放置34小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。（二）胰蛋白酶原激活向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液。将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。2用5M