酶化学-酶促反应动力学.ppt

1、第9章 酶促反应动力学,一、化学动力学基础(P351) 二、底物浓度对酶反应速率的影响(P355) 三、酶的抑制作用(P368) 四、温度对酶反应的影响(P378) 五、pH对酶反应的影响(P379) 六、激活剂对酶反应的影响(P380) 酶促反应的影响因素有哪些？,一、化学动力学基础,（一)反应速率及其测定 （二)反应分子数和反应级数 （三)各级反应的特征,（一）反应速率及其测定,反应速率以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。随着反应地进行，反应物逐渐消耗，分子碰撞的机会也逐渐减小，因此反应速率也随着减慢。 因为每一瞬间的反应速率都不相同，所以用瞬时速率表示反应速率。,用反应物浓度的减

2、少来表示： dc V= - dt 用生成物浓度的增加来表示： dc V= + dt,反应速率与时间的关系,v,（二）反应分子数和反应级数,在化学动力学中研究化学反应速率与反应物浓度的关系时，有两种分类方法：即以反应分子数和反应级数来分类。 1、反应分子数 2、反应级数,1、反应分子数,反应分子数是在反应中真正相互作用的分子数目。 仅有一个反应分子参加的反应称为单分子反应，如有机反应中的分子重排及同分异构体的相互转变等。该反应的速率方程式为： dc V= - = kc dt （c代表反应物浓度，k为比例常数）,有两个反应分子参加的反应称为双分子反应，如已酸的酯化和H2、I2化合反应等。依此类推。

3、实际上大多数反应都是单分子或双分子反应。 该反应的速率方程式为： dc V = - = kc1c2 dt （c1、c2代表反应物浓度，k为比例常数）,2、反应级数,根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。 如某反应总反应速率与浓度的关系能以单分子反应的速率方程式来表示，则该反应为一级反应。 如能用双分子反应的速率方程式来表示，则该反应为二级反应。,（三）各级反应的特征,1、一级反应 反应速率只与反应物浓度的一次方呈正比的反应。 2、二级反应 反应速率与反应物浓度的二次方（或两种物质浓度的乘积）呈正比的反应。 3、零级反应 反应速率与反应物浓度无关而受

4、它种因素影响而改变的反应。,二、底物浓度对酶反应速率的影响,(一) 中间络合物学说 (二) 酶促反应的动力学方程式 (三) 多底物的酶促反应动力学,（一）中间络合物学说,当其它条件（如酶浓度、温度、pH）不变的情况下，在底物浓度很低时，反应速率与底物浓度成正比，当底物浓度增加到一定程度后，所有的酶均与底物结合以后，反应速率不再随着底物浓度的增加而增加。 中间络合物学说: 当酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物(ES)，然后生成产物(P)，并释放出酶。 S+E ES P + E,酶促反应过程中，ES 的生成量与消失量相等， ES 浓度成一稳定状态(Steady State)，此时

5、 ES 的浓度恒定,底物浓度对酶催化反应初速率的影响,(二) 酶促反应的动力学方程式,Vmax . S 米氏方程式： Km + S,1、米氏方程推导,2、动力学参数的意义,3、利用作图法测定Km和 Vmax 值,1、米氏方程推导,各种符号所代表的意义： E：酶的总浓度 ES：酶与底物结合的中间复合物的浓度 E- ES：未与底物结合的游离状态的酶浓度 S：底物浓度,1、米氏方程推导,(1) 推导依据：中间产物学说 E + S ES E + P 只有S生成 ES，才能生成 P，k3反应为限速反应 (2)两点假设： SE S ES SES S,反应为初速度 P + E ES 可忽略,Ef=E- ES

6、 S ES,在稳态下,ES的生成速率与分解速率相等,达到动态平衡即: VES生成 = VES分解 k1Ef S=(k2+k3) ES k1(E- ES) S=(k2+k3) ES 令Km= (k2+ k3)/ k1,则 (E- ES) S/ ES= (k2+ k3)/ k1= Km 稳态时, E S ES = (1) Km+ S,(3)推导过程,由中间复合物学说可知，酶促反应分两步进行,(3)推导过程, 酶反应速率v与ES成正比，即： v= k3ES （2） 由(1)(2)知: v= k3ES/（Km+S） （3） S E, 当S很高时, 所有的酶都被S饱和成ES, 即E = ES, 酶促反应

7、速率达到最大值Vmax, 由(2)可得: Vmax= k3ES = k3E (4) (4)代入(3)得: vmaxS v= （米氏方程) Km +S,米氏方程对酶促动力学曲线的解释,（1）当SKm时, vmaxS V = km =kS （米氏方程） 反应速率与底物浓度成正比，v与S的关系符合一级动力学。,(2) 当S Km时, V = vmax 反应速率达到最大值， v与S无关，符合零级动力学，只有在此条件下才能正确测得酶活力。,(3)当 1 v= Vmax 时， S=Km 2 所以，Km值就代表反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。,2、动力学参数的意义,（1）米氏常数的意义 （2） V

8、max和Kcat的意义 （3） Kcat/Km的意义,(1)米氏常数的意义,物理意义:当反应速度达到最大反应速度（Vmax)的一半时的底物浓度。 Km的引伸意义：Km是酶学研究中的重要研究数据，表示了酶的一个基本性质。Km值是酶的特征常数之一，与酶的性质有关，而与酶的浓度无关；不同的酶其Km值不同；一个酶有几个底物就有几个米氏常数，其中Km最小的为最适底物。 P359 表9-1 一些酶的Km值 Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物，因为Km愈小表示V max对S 越灵敏。, Km与底物亲和力 Ks是底物常数，只反映ES解离趋势 1/Ks 可以准确表示酶与底物的亲和力大小 1/K m只能近似

9、地表示底物亲和力的大小？ 底物亲和力大不一定反应速度大？, 根据Km值推断某一代谢反应的方向和途径 正逆反应 Km不同，S也不同 Km最大的步骤不一定是限速步骤？ 根据Km值的大小判断分支代谢的流向 酶工程与代谢工程中改造酶的Km调控代谢途径（强化则降低Km，弱化则提升Km ） 已知Km，可计算某底物浓度下的反应速率,（2） Vmax和k3(Kcat)的意义,一定酶浓度下酶对特定底物的Vmax 也是一个常数。同一酶对不同底物的Vmax 也不同，PH、温度和离子强度等因素也影响Vmax 。 k3(Kcat)为催化常数(catalytic constant)，表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子

10、转换底物的分子数，又称为转换数，其值越大表示酶的催化效率越高。,（3） Kcat/Km的意义,Kcat/Km是E和S反应形成产物的表观二级速率常数，有时也称为专一性常数，作为酶催化效率的参数，其大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。（见P361）,k3 k1 Kcat/Km = k2 + k3,3、Km和 Vmax 值的求法,(1),选底物浓度应考虑能否得到1/S的常数增量 S为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、 5.0、10时 1/S为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。 S为常数增

11、量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时， 1/S为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。 该作图的缺点是：实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度S的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远。从而影响Km和Vmax的准确测定。S浓度增加可以解决此问题吗？,p362,p362,三、酶的抑制作用 (Inhibition),(一) 抑制程度的表示方法 (二) 抑制作用的类型 (三) 可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别 (四) 可逆抑制作用动力学 (五) 一些重要的抑制剂(Inhibitors),(一)抑制程度的表示方法,一般用反应速率的变化来

12、表示酶受抑制后活力降低的程度。若不加抑制剂时的反应速率为v0 , 加入抑制剂后的反应速率为vi , 则酶受抑制程度可用下列方法表示： 1、相对活力分数： a= vi/v0 2、相对活力百分数： a%= vi/v0 100% 3、抑制分数：指被抑制而失去活力的分数 i = 1- a = 1- vi/v0 4、抑制百分数： i%= （1- a） 100% = （1-vi/v0） 100%,（二）抑制作用的类型,抑制剂： 凡使酶的必需基团或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，称为抑制剂，用I表示，其作用称为抑制作用。 抑制作用一般分为: 不可逆抑制作用和可逆抑制

13、作用两类。 抑制剂和变性剂有何区别？,1、不可逆的抑制作用,抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称为不可逆抑制（irreversible inhibition）。,2、可逆抑制作用,（1）竞争性抑制（competitive inhibition). （2）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition). （3）反竞争性抑制（uncompetitive inhibition).,抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制(reversibl

14、e inhibition)。,竞争性抑制：底物和抑制剂结合在酶的相同位点上 S and I bind to same site on E,丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 P369 结构式,非竞争性抑制 noncompetitive inhibition 抑制剂既可以与酶结合又可以与酶与底物的复合物结合，从而抑制酶的活性。,某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制： Cu2+、Hg2+、Pb2+,反竞争性抑制 uncompetitive inhibition 酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合,1、无抑制剂，2、不可逆抑制剂，3、可逆抑制剂,可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（一）,（三）

15、可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别,可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别,v,0,E,v,0,E,I,I,可逆抑制剂的作用,不可逆抑制剂的作用,(四) 可逆抑制作用动力学,（1）竞争性抑制 （2）非竞争性抑制 （3）反竞争性抑制,V=,VmaxS,Km(1+I/Ki)+S,Vmax 不变 Km增加,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,（五）一些重要的抑制剂（P373）,1、不可逆抑制剂 （1）非专一性不可逆抑制剂 有机磷化合物 与酶活性直接有关的丝氨酸上的-OH共价结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶，强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。 二异丙基磷酰氟（DFP,p374）和许多有机磷农药。 解毒剂：P

16、AM （解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。,有机磷化合物,解磷定的解毒作用,其他非专一性不可逆抑制剂,有机汞、有机砷化合物与酶蛋白上的-SH作用， 从而抑制含-SH酶的活性。（路易斯毒气） 氰化物，硫化物和CO与酶中的金属离子络合，使酶失活. 重金属能使大多数酶失活，加入EDTA可以除去. 烷化剂一般含有活泼卤素原子，使酶蛋白中的SH、-NH2、-OH等发生烷基化,失活。 青霉素与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合，使酶失活。,（2）专一性不可逆抑制剂,1）Ks型： 根据底物结构设计，是底物类似物，也称亲和标记试剂 Ks Ki E + S ES E-I ， 专一性取决于Ks 如：TLCK（

17、对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮，胰蛋白酶抑制剂） 活泼的氯甲酮基团攻击胰酶活性中心的底物结合位His57，引起酶的不可逆失活,2）Kcat型：,根据酶作用机制设计，本身是酶的底物，含潜伏性反应基团(latent group)，因酶的作用而暴露或活化并攻击酶的活性中心，使酶不可逆失活。该抑制剂具有极高的专一性，也称为：自杀性底物 (suicide substrate) Ks Kcat Ki E + Si E Si EI E-I 抑制效率更多的取决于Kcat值，专一性极高 如：-卤代-D-Ala，是Ala消旋酶（能使L- Ala转变为 D- Ala ） 的自杀性底物,2、可逆抑制剂,FH2还原酶,TMP,叶酸及结构,四、温度对酶反应的影响,温度对酶的作用有两种不同的影响： 与化学反应相同，酶反应在一定的温度范围（0-40）内，其速度随温度升高而加快。根据一般经验，温度每升高10，反应速度约增加1倍。 酶遇热易变性失去活性，绝大多数酶在60以上即失去活性。在低温范围内，前一种作用占主要地位，因此随着温度升高，反应速度加快。但当温度升到一定限度时，后一种作用明显产生影响。在一定条件下，每一种酶在某一定温度，其活力最大，这个温度称为酶的最适温度。(如图所示),五、pH对酶反应的影