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文档简介

1、实时荧光定量pcrtaqman探针法,序列选取应在基因的保守区段； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 tm值在5565，gc含量在40%60%； 引物之间的tm相差避免超过2； 引物的3端避免使用碱基a，引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基； 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； taqman探针技术要求片段长度在50bp150bp； 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的g和c。,taqman技术引物设计原则,ta

2、qman探针设计原则,先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针； 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性； 探针的dna折叠和二级结构；尽量避开二级结构； tm值在65-70，通常比引物tm值高5-10（至少要5），以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，gc含量在40%70%； 探针的5端应避免使用g鸟嘌呤因为5g会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用； 整条探针中，碱基c的含量要明显高于g的含量g含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。,taqman mgb 探针设计,探针的5端避免出现g，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的g碱基仍可淬灭基团的荧光信号。 tm值应为65-67。 尽量缩短taqman mgb探针，但探针长度不少于13bp。 尽量避免出现重复的碱基，尤其是g碱基，应避免出现4个或4个以上的g重复出现。 原则上mgb探针只要有一个碱基

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