毒理学实验设计

1、毒理学实验设计 镉对小鼠肾脏的急性毒性作用机制实验设计 设计者：叶佳增 3120304126 黄辉武 31203041271、 实验背景及依据：随着现代工业的迅猛发展 ,环境污染对人体健康的影响日益严重 ,有关环境有毒物质对机体的毒性作用及其机制的研究受到普遍关注。镉 ( cadm ium , cd )是一种极其重要的工业和环境化学污染物 ,因其对环境水、空气和土壤的污染而在动植物体内蓄积 ,最终导致对人类健康的危害 ,并由于它在体内能长期蓄积 ,不易排除 ,故易产生慢性的和远期的病理效应 ,可损伤许多组织和系统。在人和动物慢性镉中毒最常见的症状是生长迟滞、肾功能衰竭、生殖功能减退、高血压、肿

2、瘤和畸胎等。镉污染问题已受到世界各国高度重视 ,美国毒性管理委员会 ( atsrd ) 已把镉列为第六位危害人体健康的有毒物质 ,联合国环境规划署 (dnfp)也把镉列入重点研究的环境污染物 ,世界卫生组织 (who )则将其作为优先研究的食品污染物。我国是重金属丰产国家 ,镉污染现象也相当严重 1 。来自不同领域的研究分别试图从整体水平、器官系统水平和细胞分子水平阐明镉对机体的毒性作用及其机制 ,以便为预防及治疗由其引起的疾病提供有效的方法。因此 ,研究镉污染对生物体的毒性作用及保护对策具有重要理论意义和实践指导价值。2、 实验目的和意义： 目的：了解镉的急性损害作用，镉对肾脏毒性的蓄积作用

3、 意义：通过了解镉的急性作用，掌握镉的危害，同时积极预防镉的污染。掌握随机分组方法，以及实验数据的统计。三、实验仪器与试剂：1、氯化镉（cdcl2、ar）、蒸馏水、0.9%生理盐水2、小鼠肌酐elisa试剂盒（ 酶联板(assay plate )：一块(96孔)、标准品(standard)：2瓶(冻干品)、样品稀释液(sample diluent)：120ml/瓶、生物素标记抗体稀释液(biotin-antibody diluent)：110ml/瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(hrp-avidin diluent)：110ml/瓶、生物素标记抗体(biotin-antibody)：112

4、0l/瓶(1：100)、辣根过氧化物酶标记亲和素(hrp-avidin)：1120l/瓶(1：100)、底物溶液(tmb substrate)：110ml/瓶、浓洗涤液(wash buffer)：120ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍、终止液(stop solution)：110ml/瓶(2n h2so4) ）3、小鼠尿微量白蛋白酶联免疫分析盒（48孔配置96孔配置封板膜2片、酶标包被板 148 196（2-8保存）、标准品540g/l 0.5ml1瓶 0.5ml1瓶 、标准品稀释液1.5ml1瓶 1.5ml1瓶、酶标试剂 3 ml1瓶 6 ml1瓶、样品稀释液 3 ml1瓶 6 ml1

5、瓶（2-8保存）、显色剂a液 3 ml1瓶 6 ml1瓶、显色剂b液 3 ml1瓶 6 ml1瓶、终止液 3ml1瓶 6ml1瓶、浓缩洗涤液 20ml20倍1瓶 20ml30倍1瓶 ）4、标准规格酶标仪、高速离心机、电热恒温培养箱、干净的试管、eppendof管、系列可调节移液器及吸头、容量瓶、移液枪5、动物秤、灌胃针、毛细管、洁净带刻度容器、外科剪、镊子、滤纸6、实验动物：健康成年清洁级昆明种小鼠49只，雌雄各半，体重2027g，由实验动物中心提供。四、预实验随机将9只健康成年小鼠分为3组，分别给予药物剂量0、0.20、5.00mg/kg，如果最大剂量组有死亡没全死，应加大剂量找出全死剂量，

6、如果全没死，则应考虑做最大耐受量。然后根据摸索出来的0100%致死量之间选择4个剂量组做实验。五、实验方法：1、分组与称重 将40只小鼠雌雄各半，随机分为4组，共8组；分别称量小鼠体重，并做好记录。2、染毒以生理盐水配置cdcl2溶液，cdcl2染毒剂量分别为0.05、0.10、0.20mg/kg，染毒组小鼠进行灌胃染毒（10mg/kg体重），对照组注射生理盐水（10mg/kg体重），动态观察小鼠的症状和体征。3、 收集尿液 每隔1小时，用洁净带刻度容器收集小鼠尿液（采用反射排尿法：提起小鼠尾巴，将其倒立，尿液便流出）。4、 血清肌酐含量的测定4.1采用后眼眶静脉丛取血法进行采血，采血量1ml

7、，编号。4.2血清制备：全血标本请于室温放置2小时后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测。4.3加样：分别设空白孔、标准孔、待测血清样品孔。空白孔加样品稀释液100l，余孔分别加标准品或待测样品100l，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。4.4弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100l(取1l生物素标记抗体加99l生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37,60分钟。4.5温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干

8、，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350l/每孔，甩干。4.6每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100l，37，60分钟。4.7温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350l/每孔，甩干。4.8依序每孔加底物溶液90l，37避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。4.9依序每孔加终止溶液50l，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。4.10用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光

9、密度(od值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。5、处死、剖腹采尿与肾脏提取5.1 5小时后分别称量小鼠体重，记录数据；5.2颈椎脱臼法处死，处死后剖腹暴露膀胱，用无齿小平镊夹住一小部分膀胱，迅速持针在小镊夹住的膀胱部位直视穿刺抽取尿液，收集在前述的洁净带刻度的容器内。5.3并立即取出肾脏并剥离周围脂肪及结缔组织，用生理盐水洗净后用滤纸吸干，称量肝脏重量，记录数据并计算脏器系数。6、尿微量白蛋白含量的测定6.1 尿液的收集与处理2000-3000转/分离心20分钟左右，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。6.2 标准品的稀释与加样在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔

10、中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀，然后从第一孔、第二孔中各取100l分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀，然后在第三孔和第四孔中先各取50l弃掉，再各取50l分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀，混匀后从第五、第六孔中各取50l分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l弃掉。稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为360g/l、240g/l

11、、120g/l、60g/l、30g/l。6.3 加样分别设空白孔、待测样品孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l，样品最终稀释度为5倍。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。6.4 温育用封板膜封板后置37温育30分钟。 6.5 配液将30（48t的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48t的20倍）倍稀释后备用。6.6 洗涤小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 6.7 加酶每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。6.8 温育用封板膜封板后置37温

12、育30分钟。6.9 洗涤6.10 显色每孔先加入显色剂a50l再加入显色剂b50l轻轻震荡混匀37避光显色15分钟. 6.11 终止每孔加终止液50l终止反应，此时蓝色立转黄色。 6.12 测定以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度od值。 六、 实验计算：1、血清肌酐浓度的计算以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，od值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的od值由标准曲线查出相应的浓度；若有稀释再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。2、尿微量白蛋白浓度的计算以标准物的浓度为横坐标，od值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的od 值由标准曲线查出相应的浓

13、度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。3、 肾脏系数的计算：肾脏系数=肾脏重量（g）/体重（g）100%七、 预期实验结果：本实验所得染毒前后体重差、小鼠肾脏系数、血清肌酐含量、尿蛋白含量，按照方差分析法，预计各实验组之间及实验组和对照组比较差异均无统计学意义（p0.05），尚不能证明镉对肾脏组织有损伤作用。八、 实验数据处理与结论：建立excel数据库，分别输入各组实验数据，运用spss11.5统计软件，采用方差分析法进行统计处理。表1 小鼠染毒前后体重差 cdcl2（mg/kg） 0.9%生理盐水 合计编号 0.050 0.100 0.200 123 45678910排除异常值之后小鼠数

14、量平均值标准差方差方差分析1变异来源 ss df ms f p总变异组间组内按照方差分析法，算出各实验组之间及实验组和对照组比较差异有无统计学意义。表2 五种方案处理后小鼠肾脏系数 cdcl2（mg/kg） 0.9%生理盐水 编号 0.050 0.100 0.200 123 45678910方差分析2变异来源 ss df ms f p总变异组间组内按照方差分析法，算出各实验组之间及实验组和对照组比较差异有无统计学意义。表3 五种方案处理后小鼠血清肌酐含量（mg/ml） cdcl2（mg/kg） 0.9%生理盐水 合计编号 0.050 0.100 0.200 123 45678910排除异常值之后小鼠数量平均值标准差方差方差分析3变异来源 ss df ms f p总变异组间组内按照方差分析法，算出各实验组之间及实验组和对照组比较差异有无统计学意义。表4 五种方案处理后小鼠尿微量白蛋白含量（ug/ml） cdcl2（mg/kg