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文档简介
1、实验二,小鼠脾脏淋巴细胞的分离,小鼠脾脏淋巴细胞的分离,目的 原理 实验步骤 注意事项,目的,熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞(pbmc)的分离方法,原 理,脾脏各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。,原 理,外周血,红细胞,粒细胞,单个核细胞,血小板,淋巴细胞,单核细胞,1.093,1.0301.035,1.0751.090,ficoll:1.0770.001,(pbmc),1.092,1500rpm, 20 , 30min,pbmc,红细胞粒细胞,ficoll,稀释外周血,ficoll,稀释
2、的血浆、血小板,实验步骤,1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨(研磨同时滴加1640培养液,保持细胞活性) 2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取,沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层液上方(ficoll:血细胞=1:1),实验步骤,3.2000r/min,离心15min 4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移入另一试管中,实验步骤,5.加足量稀释液充分洗涤,1000 r/min离心5min ,弃上清 6. 适量的培养基重悬细胞 ,计数,注意事项,1.在ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面 2. 吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染,细胞计数,实验步骤 注意事项,实验步骤,1、准备计数板: 2、制备细胞悬液:收集细胞,制成单个细胞悬液 3、加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液, 4、计数:在显微镜下,用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数,实验步骤,5、计算:将结果代入下式,得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =(4大格细胞数之和/4)104,注意事项,1.取样计数前,应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片,也不要过少或带气泡 3.细胞压中线时,数上不数下,数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时,细胞数过少或过
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