分子生物学第10讲课件

1、分子生物学第10讲,第四章 以修复作用为中心的DNA的安全保障体系,分子生物学第10讲,导致DNA不稳定的因素 1，偶然的复制错误 2，环境紫外线、电离辐射化学物质（突变剂）造成的核酸分子损伤 3，外源遗传物质的侵入,分子生物学第10讲,保证DNA稳定性的机制 1，复制修复系统 2，损伤修复系统 3，限制-修复系统,分子生物学第10讲,第一节 复制修复,一、尿嘧啶糖基酶系统 （一）DNA中尿嘧啶的产生 （二）尿嘧啶糖基酶系统的组成 （三）修复过程,分子生物学第10讲,二、错配修复系统（mismatch repair system） （一）错配修复系统的组成 （二）错配修复的过程,分子生物学第1

2、0讲,1，错配矫正酶与未甲基化的GATC及同一条链上的错配碱基结合 2，错配矫正酶在两者之间切除一段包括错配碱基的DNA单链,分子生物学第10讲,3，DNA聚合酶III进行缺口充填 4，DNA连接酶连接切刻,分子生物学第10讲,（三）错配修复系统其他作用 1，去除渗入DNA的碱基类似物 2，在基因转换中起重要作用,分子生物学第10讲,第二节 损伤修复,致损伤因素 DNA分子损伤的类型 一、胸腺嘧啶二聚体的产生及其后果 二、胸腺嘧啶二聚体修复的生物学指征 （一）细菌的活存曲线 （二）修复类型,分子生物学第10讲,1，光复活（photoreactivation） 2，暗修复 除了可作用于胸腺嘧啶二

3、聚体外，还可以修复其他类型的损伤，包括： （1）切除修复 （2）重组修复 （3）SOS修复 （4）二聚体糖基酶修复,分子生物学第10讲,三、胸腺嘧啶二聚体修复的分子生物学机制 (一）光复活（photoreactivation） 1，光复活的定义 2，光复活的过 （二）切除修复 1，切除修复一般过程 2，大肠杆菌的切除修复 （1）修复过程,分子生物学第10讲,（2）大肠杆菌切除修复的类型 短补丁修复（short-patch repair） 长补丁修复（long-patch repair） 3，真核生物的切除修复,分子生物学第10讲,（三）重组修复 1，除Uvr系统之外，还存在其他的暗修复系统 2

4、，重组修复（复制后修复）的机制 （1）重组修复的姐妹链交换假说（图4-10） （2）重组修复所涉及的基因,分子生物学第10讲,（四）SOS修复 1,SOS反应 2,SOS修复的概念 3,SOS修复的结果 4,RecA蛋白在SOS修复中的作用,分子生物学第10讲,(1)RecA蛋白的主要生化活性 (2) RecA蛋白的作用 5,LexA蛋白在在SOS修复中的作用 (1)LexA蛋白的作用 是一种阻遏蛋白,结合于SOS系统中各基因的操作子上,使得这些基因不能产生转录产物,分子生物学第10讲,对自身基因的表达也有负向控制作用,但正常细胞中其表达量足以阻遏所有SOS基因的表达 当细胞DNA复制受阻时，

5、LexA蛋白被RecA蛋白触发，发生自身催化的水解作用，SOS系统被激活，lexA基因表达也增加,分子生物学第10讲,分子生物学第10讲,DNA复制正常后,RecA蛋白失活,LexA蛋白恢复对SOS系统的阻遏作用,分子生物学第10讲,(2)由LexA控制的SOS基因构成一个调控元 LexA控制17个基因,统称din(damage inducible genes)基因,或SOS基因 SOS框：所有SOS基因的操作子都含有20bp的LexA结合位点,称为SOS框(SOS box),分子生物学第10讲,（五）嘧啶二聚体糖基酶修复系统 与非标准碱基的修复机制相同,分子生物学第10讲,四、其他损伤类型及

6、其修复 （一）非标准碱基的修复 1，非标准碱基及其相应的DNA糖基酶 非标准碱基包括：尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤等 第一类DNA糖基酶无内在AP内切酶活性 第二类DNA糖基酶有内在AP内切酶活性,分子生物学第10讲,2， DNA糖基酶的修复机制 与尿嘧啶糖基酶的修复机制相同 第一类去除非标准碱基后，还可以通过DNA碱基插入酶进行修复,分子生物学第10讲,（二）碱基的丢失 1，去嘌呤作用（depurination）：嘌呤碱基自发水解导致 2，无碱基内切酶的作用 修复去嘌呤作用造成的损伤，也负责修复DNA中的尿嘧啶和次黄嘌呤 特异切断无碱基核糖的5-磷酸的3-酯键,分子生物学第10讲,3，碱

7、基插入酶 目前只发现一种嘌呤碱基插入酶 专一性在AP位点插入互补的嘌呤碱基 嘌呤碱基的供体可以是自由碱基或嘌呤脱氧核苷。大肠杆菌的酶可以利用dATP和dGTP,分子生物学第10讲,（三）烷基化损伤的修复 1，烷基化的主要位点 嘌呤碱基的N-7、N-3位、O-6位以及磷酸骨架 2，Ada蛋白在烷基化损伤的修复中的作用,分子生物学第10讲,（1）ada基因产物 Ada蛋白（O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶，MGMT）有354个Aa，39KDa （2）Ada蛋白的自杀行为 Ada蛋白可去除鸟嘌呤O6甲基，及甲基磷酸三酯上的甲基。两种甲基分别不可逆地结合于该酶的Cys321和Cys69上。去除一个甲基要消耗

8、一个酶分子。,分子生物学第10讲,3，E.coli对烷基化的适应性反应 （1） Ada蛋白的作用 携带了甲基的Ada蛋白成为自身基因和其他三个基因（alkA，alkB，aidB）的诱导物，结合于基因RNA聚合酶结合位点的上游。其结合位点的一致序列为：AAANNAAAGCGCA,分子生物学第10讲,（2）alkA基因的作用 编码烷基化DNA糖基酶，该酶能去除3-甲基腺嘌呤， 3-甲基鸟嘌呤，O2-甲基胞嘧啶， O2-甲基胸腺嘧啶等烷基化碱基 （3）alkB的作用 基因产物负责细胞毒素损伤的DNA的切除修复,分子生物学第10讲,（四）链的断裂 1，造成DNA链断裂的因素 2，修复方式 （1）单链断

9、裂修复 有一部分是直接通过DNA连接酶将切刻两端的5磷酸根与相邻的3羟基连接加以修复,分子生物学第10讲,（2）双链断裂修复 已知参与双链断裂修复的哺乳动物基因有： DNA-PK，XR-1，XRFCCI基因 修复的简单过程是：断裂的末端被切平，产生3-OH和5-P，然后两个片段被连接起来。,分子生物学第10讲,（五）交联 1，致交联因素 某些抗生素（如丝裂霉素） 致癌剂和化疗药 2，交联种类 链内交联 链间交联 3，修复方式 主要依靠切除修复,分子生物学第10讲,（六）真核生物的修复系统 1，酵母 与辐射损伤修复有关的基因统称为rad基因，分成三组： （1）与切除修复有关 （2）与复制后修复有

10、关 （3）与重组修复有关,分子生物学第10讲,各种修复都与转录过程有关，都倾向性地修复具转录活性的基因，而且是首先修复模板链。可能修复与RNA聚合酶有联系。现已知rad3基因编码一种螺旋酶（helicase），是与RNA聚合酶结合的一种转录因子，是对损伤区切割所必需的。,分子生物学第10讲,2，哺乳动物 对损伤DNA的修复机制同原核细胞的切除修复机制相似。已知哺乳动物切除修复相关的基因与酵母的rad基因存在同源性，表明切除修复机制在各种生物中是高度保守的 哺乳动物中已发现了重组修复机制。这些修复系统都与遗传重组过程有关,分子生物学第10讲,3，真核生物蛋白质的多聚ADP核糖基化与DNA修复的关

11、系 （1）真核生物蛋白质的多聚ADP核糖基化（ADP-ribosylation） 在DNA断裂作用的刺激下，ADP核糖基转移酶（ADPRT）迅速从NAD+上将ADP核糖基转移到许多核蛋白（包括ADPRT自身）上。,分子生物学第10讲,（2）多聚ADP核糖基化的可能作用 观点一 核糖基化的蛋白质通过目前未知的途径促进DNA的修复,分子生物学第10讲,观点二 ADP核糖基化使磷酸核糖焦磷酸（PRPP）和ATP的储备急剧下降，DNA损伤严重的情况下可能导致细胞死亡。 意义：防止畸变的DAN修复结果被复制而固定下来,分子生物学第10讲,第三节 限制与修饰（restriction and modific

12、ation）,一、限制-修饰现象 1，大肠杆菌噬菌体的限制和修饰模式 表4-2,分子生物学第10讲,2，大肠杆菌的限制-修饰系统 （1）限制-修饰作用：大肠杆菌的一种酶系统可以识别外来的DNA，并以其限制性内切酶活性将之切断（限制）；另一方面，该系统可以识别细胞内DNA中相同的限制性内切酶切割位点，并对位点内的腺嘌呤或胞嘧啶进行甲基化修饰（修饰），使之免遭限制性切割，这两方面的作用即为限制-修饰作用。大肠杆菌的这种酶系统就称为限制-修饰系统。,分子生物学第10讲,3，居民DNA 同一细胞内具有同样的限制-修饰模式的不同类型的DNA，包括细胞DNA，质粒DNA，噬菌体DNA等,分子生物学第10讲

13、,二、限制-修饰系统的分类 （一）细菌中三种不同类型的修饰-限制酶 表4-3 （二）II类修饰-限制酶,分子生物学第10讲,1，酶分子的构成 限制酶和修饰酶是独立的两个酶 2，识别位点 一般为4-6个bp的回文序列 3，切割位点 大多数酶作用于底物DNA双链，位点在识别序列中或靠近识别序列 少数酶能作用于回文序列相应DNA单链序列,分子生物学第10讲,4，对底物的作用 全甲基化底物：不限制，不修饰 半甲基化底物：不限制，修饰 非甲基化底物：限制，不修饰,分子生物学第10讲,5，酶切位点 粘性末端和平齐末端：限制酶在DNA两条链上的切口位置不同产生不同的末端。粘性末端可以是5端的，也可以是3端的

14、。 同位酶：识别相同序列而切点不同的限制酶 同尾酶：识别序列不同而切割产生的粘性末端相同的限制酶,分子生物学第10讲,（三）I类酶 1，酶分子的构成 （1）三个亚基： R、M、S亚基 分别由hsdR、hsdM、和hsdS基因编码； 三个基因属同一个操纵元,分子生物学第10讲,（2）两种功能 R、M亚基负责限制和修饰 S亚基负责识别DNA序列上特异靶位点 （3）基因突变和万一保安机制 三个基因突变的表型 万一保安机制：M亚基参与R亚基的功能，使M亚基突变时不致造成致死表型,分子生物学第10讲,2，I类酶的作用位点 （1）EcoB和EcoK的识别位点：一段3bp的序列和一段4bp的序列中间夹着一段

15、任意序列 EcoB的识别序列： TGA（N）8TGCT EcoK的识别序列： AAC（N）6GTGC,分子生物学第10讲,（2） EcoB和EcoK的甲基化位点 EcoB的甲基化位点：DNA双链上N8任意序列两侧的两个腺嘌呤 EcoK的甲基化位点：不详 （3） I类酶的切割位点 距识别位点1000bp以上,分子生物学第10讲,3， I类酶的限制-修饰机制 图4-15 （1）M亚基首先与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合，酶分子变构处于活化状态 （2）酶-SAM与DNA结合后，在ATP的参与下，对不同甲基化程度的底物产生不同的限制-修饰作用 限制性切割位点的序列无特异性，但位点的选择也并非是

16、完全随机的,分子生物学第10讲,4， I类酶识别切割位点的机制 （1）酶移动假说 酶分子与识别位点结合 酶分子沿着DNA移动（原因未知）直到它实施切割,分子生物学第10讲,（2）DNA移动假说 酶分子有两个位点与识别位点的两端特异性碱基序列结合 在ATP存在时，酶分子发生变构，以一个位点与DNA的一端特异性序列结合（可能是四个碱基的序列）,分子生物学第10讲,酶分子将另一边的DNA双螺旋从中间拉过来，通过分子上不结合DNA的结合位点的检查，发现DNA上的切割位点，将DNA的一条链切断 消耗大量ATP，释放共约70b的寡核苷酸片段 可能由第二个酶分子将DNA的另一条链切断,分子生物学第10讲,（四）III类酶 III类酶非常稀有，目前只有三个系统得到了研究，即大肠杆菌质粒P1、P15编码的EcoP1和EcoP15，以及流感菌Rf中的Hinf,分子生物学第10讲,1，酶的组成及功能 R亚基，负责限制反应；R亚基基因突变，产生R-M+表型 MS亚基，负责识别和修饰；MS基因突变，可产生R-M-（识别区突变)或R+M-致死突变（修饰部分突变）,分子生物学第10讲,2，识别和修饰位点 同一个位点，也是在腺嘌呤上甲基化，由SAM提供甲基 修饰只