质粒DNA的提取及电泳检测

1、实验 质粒 DNA 的提取及电泳检测一 实验目的通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。二 实验原理1. 细菌中有两种 DNA，即染色体 DNA和质粒 DNA。2.质粒 DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3.碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状 DNA由于空间缠绕， 两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒 DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。三 实验材料 ：转化后的细菌 ( 含有质粒的大肠杆菌 )四、实验用具和药品1. 实验用具 :摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（1

2、5mL）及塞子，离心管（ 1.5mL）2.实验试剂：（ 1）溶液I50 mmol/L25 mmol/L10 mmol/L葡萄糖三羟甲基氨基甲烷（ Tris ）Tris乙二胺四乙酸（ EDTA）（pH8.0）HCl（ pH8.0）（ 2）溶液II0.4mol/L NaOH，2%SDS，用前等体积混合（ 3）溶液III5 mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml（ 4） TE 缓冲液10 mmol/L TrisHCl（ pH8.0）1 mmol/L EDTA（pH8.0）（ 5） 70%乙醇（放 - 20冰箱中，用后即放回）（ 6）加样缓冲液（ 6X）： 40%蔗糖、 0.25%溴

3、酚兰（ 7）电泳缓冲液：0.045mol/L Tris-硼酸0.001mol/L EDTA（0.5X TBEbuffer ）电泳缓冲液贮存液： 5X：54g Tris 碱、27.5g 硼酸、20ml 0.5mol/L EDTA（ pH8.0）五 实验步骤（一）细菌繁殖挑取白色的单菌落若干，转移到3mL 液体LB 培养基 ( 附加100mg/mlAmp ),37 过夜振荡（ 200r/min ）培养。（二）菌体收集将过夜培养的菌体转入1.5mL 离心管，离心30sec 5000r/min ；弃上清提取质粒（三）质粒提取方法一：碱裂解法提取质粒DNA1. 将上述沉淀重悬于250L冰预冷的溶液中，剧

4、烈震荡；2加入 250L溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管510 次；3加入 350L冰预冷的溶液，盖紧管口，温和地颠倒离心管510次；9000r/min离心 5min 上清转移到另一新1.5mL 离心管中；4加等体积氯仿，振荡混合，静置，9000r/min离心 5min，上清转移到另一新1.5mL 离心管中；5加入 1/10 体积 3mol/L 的醋酸钠和 2 倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min 离心 5min；6弃上清，用 70 ethanol 洗涤；7加 30LTE溶解， - 20 保存。方法二：试剂盒提取方法1. 离心收集的菌体中加入含 RNAase的溶液 250L，

5、重悬菌体，不应留有小的菌块；2. 加溶液 250L，轻轻颠倒离心管 4-6 次，使菌体充分裂解，至溶液澄清；3. 加入 350L冰预冷的溶液，温和并充分地上下翻转混合6-8 次；4. 12000r/min 离心 10min；5. 将上清转移到 DNA结合管（置于 2 ml 离心管中）， 12000r/min 离心 1min，弃滤液；6. 将制备管置回离心管，加入去蛋白试剂 500L， 12000r/min 离心 1min，弃滤液；7. 将制备管置回离心管，加洗涤液 700L， 12000r/min 离心 1min，弃滤液；以同样的方法再用 700L洗涤液洗涤一次，弃滤液。8. 将制备管置回 2 ml 离心管中， 12,000 g 离心 1 min ，去除残余的洗涤液；10 将 DNA结合柱放入另一个新的 1.5mL 离心管中，在制备管膜中央加 60-80 L 洗脱液或去离子水，室温静置 1 min 。12,000 g 离心 1 min 。（四）检测提取DNA质量的电泳检测。取 4ul 质粒 DNA+2ul加样缓冲液 +6ul ddH2O；配制 1%的琼脂糖凝胶电泳 30min， EB染色，拍照。注意事项：氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、口罩。六 实验作业1. 思考本实验的关键步骤是什么？2. 琼脂糖电泳鉴