生物技术制药：发酵工程制药-2

1、第五节 发酵工程中的代谢控制与代谢工 程,微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。 在发酵工业中，调节微生物生命活动的方法很多，包括生理水平、代谢途径水平和基因调控水平上的各种调节。,调节代谢流的方式最为重要，包括调节酶的合成量和调节现成酶分子的催化活力。 利用微生物代谢调控能力的自然缺损或通过人为方法获得突破代谢调控的变异菌株，可为发酵工业提供生产有关代谢产物的高产菌株。,微生物的代谢调节和代谢工程,原则：经济合理地利用和合成所需的各种物质和能量，使细胞处于平衡生长状态。 方式：反馈抑制、反馈阻遏、酶的诱导调节、酶的共

2、价修饰。 生产目的：高浓度地积累人们所期望的产物 平衡 打破 建新平衡高浓度地积累 办法：育种，得到根本改变代谢的基因突变株 控制微生物培养条件，影响其代谢过程。 代谢工程：利用基因工程技术，扩展和构建、连接，形成新的代谢流。（也称途径工程）,二、代谢产物合成的调控,（一）发酵条件的控制 控制代谢条件，影响微生物自身的代谢调节系统，改变代谢方向,发酵条件不同，产物不同。表7-5,各种发酵条件对微生物的影响 同菌种，同培养基，培养条件不同，可获不同代谢产物（途径不同）。啤酒酵母，用葡萄糖，中性产乙醇，酸性产CO2，碱性产甘油。,1.使用诱导物 可用底物或底物类似物有效增加诱导酶的产量 水解酶类大

3、都属诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量。 如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C，加入巴比妥可提高利福霉素产量等。,.控制细胞膜的渗透性 改变细胞渗透性，可使代谢产物容易从细胞渗出，可解除反馈抑制 如蛋氨酸诱导顶头孢霉菌细胞壁和细胞膜发生改变，促进了使头孢霉素C的合成,如：生产中生物素限量，影响脂肪酸的合成，形成有利于谷氨酸渗透的细胞膜 添加青霉素，抑制肽聚糖中肽链交联 加入表面活性剂tween-80 选育油酸和甘油缺陷型,谷氨酸积累与细胞膜渗透关系,3.添加生物合成前体 菌体吸收前体后直接合成该产物，不受反馈调节控制。 如青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速性因子，

4、补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。 表7-6,4.解除末端产物的反馈调节 生物合成中存在反馈调节，一般末端产物抑制合成途径第一个酶 近年发展了生物反应与产物分离偶联技术（原位产物产物分离偶联技术） 如：吸附发酵（活性碳，硅藻土等）,5.解除分解代谢物阻遏 发酵过程中，由于碳源的分解产物的阻遏作用，葡萄糖，甘油等碳源耗尽时才进行次级代谢产物积累。 两种方法解除代谢物阻遏：变换C：N比或控制葡萄糖流加或滴加量，限制葡萄糖浓度，使降解物阻遏降低,青霉素、头孢菌素C、紫丝霉素、吲哚霉素、丝裂霉素、杆菌肽、香豆霉素等都有类似现象 青霉素生产中使发酵菌处于半饥饿状态，延长青霉素合成,（二）各种突

5、变株的应用,.应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节 选育丧失合成途径中的某一种酶的突变株 在直线式的合成途径中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物。但在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。,利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子 如用谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型菌株生产鸟氨酸 谷氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸,谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径 乙酰谷氨酸合成酶 乙酰谷氨酸激酶 NO乙酰谷氨酸醛脱氢酶 乙酰鸟氨酸转氨酶 NO乙酰谷氨酸O乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶 鸟氨酸氨甲酰基转移酶 精氨琥珀酸合成酶 精氨琥珀酸酶,直线式的合成途径,

6、分支代谢途径,天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制,通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。,在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制,突变型能过量生产L-赖氨酸,2.抗代谢类似物突变株的应用 生物合成途径清晰的，难以得到营养缺陷型的，可筛选抗类似物（analog）突变株 如天冬氨酸激酶是赖氨酸生物合成途径中的调节酶，由黄色短杆菌分离到对赖氨酸的类似物(2-氨基半胱氨酸)有抗性的突变株，它对天冬氨酸激酶的反馈抑制不敏感，赖氨酸的产量可达55mgm1。,抗反馈调节突变株； 抗反馈调节突变株是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性

7、的组成型菌株，或兼而有之的菌株。如苏氨酸发酵：,抗阻遏和抗反馈突变型,抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。,选育结构类似物抗性突变株,结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质,主要用于末端产物的积累,3.抗生素抗性突变株的应用 筛选抗生素抗性突变体，也能取得由此而改变代谢调节，获得过量生产的结果。 衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的-淀粉酶的产量较亲株提高了5倍（分泌机制改变的结果） 抗利福平的蜡状芽抱杆菌的无芽孢突变株的-淀粉酶产量提高了7倍（芽孢形成的延迟利于-

8、淀粉酶的形成，而抗利福平的突变株往往失去了形成芽抱的能力）,还可通过基因工程的方法增加抗性基因的拷贝数 抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高 将,例： 螺旋霉素抗性基因srmB 重组质粒 转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌） 转化子 使螺旋霉素产量提高。,三、定向发酵,1. 抗生素生物合成基因 已有23种以上抗生素的结构基因被克隆，其中包括放线紫红素、次甲基霉素及红霉素完整的生物合成基因簇。,克拉维酸,2.抗生素生物合成基因的结构特点； （1）链霉素生物合成基因GC含量高，三联密码子中第3个碱基的G、C比例极高 （2

9、）抗生素生物合成基因约10-30个大多处于一个基因簇中，包括抗生素合成基因，抗性基因、调节基因、抗生素分泌和与胞外处理功能有关的基因 （3）有些在质粒上，如：SCP1质粒上的次甲霉素基因簇,3.几种典型的抗生素生物合成基因簇的结构 结构上不同的代谢产物在编码基因上的相关性，如内酰胺类、多肽类、糖肽类都主要由非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS) 负责合成，四环素类、大环内酯类、安莎类、聚醚类则由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS) 合成。,I型聚酮合酶,非核糖体肽合成酶,（1）放线紫红素actinorhodine

10、 链霉菌的模式种天蓝色链霉菌全基因组序列的公布 放线紫红素聚酮体类抗生素，聚酮体合成酶PKS为II型结构,（2）红霉素 6-dEB（6-脱氧红霉素内酯）是红霉素合成途径中最早的中间体，在羟化酶的作用下，形成红霉素内酯参与生物合成。早期曾获得不能合成6-dEB的突变株2NU153，添加一系列的红霉素内酯类似物，合成了许多新的衍生物。 6-dEB是在聚酮合成酶PKS催化作用下，由丙酰-CoA和六个甲基丙二酰-CoA以类似脂肪酸合成的途径生成的。DEBS包括三个亚基:DEBS1、DEBS2和DEBS3，每个亚基包含两个模块 聚酮体合成酶为I型结构,（3）青霉素,异青霉素N（异青霉素N合成酶，IPNS

11、）是青霉素和头孢霉素的分支点,(L-氨基己二酰)-(L-半胱氨酰)-D-缬氨酸合成酶 acv合酶,扩环酶,在头胞霉素合成途径中，扩环酶将青霉素N催化形成 去乙酰氧头胞霉素C(ADOC)，头胞霉素合成的限速步骤 将链霉菌扩环酶基因（cefE）克隆后转化青霉菌（产青霉素V），转化子可直接发酵产生去乙酰氧头胞霉素V，经过体外青霉素V酰化酶水解得到7-氨基脱乙酰头胞烷酸（7-ADCA） 是半合成头胞霉素的重要母核之一,（一）突变生物合成(mutational biosynthesis) 突变生物合成(MBS)：生物合成途径中的某一位点发生突变。丧失合成完整抗生素分子的能力而成为阻断突变株。发酵阻断突变

12、株时添加某些中间体，突变株利用中间体合成一些新结构化合物. 该方法主要用于抗生素的结构改造,阻断突变株： 营养缺陷型：初级代谢阻断突变株 独需型idiotroph:能正常生长，编码抗生素的基因突变，导致不能合成，即次级代谢阻断突变株，需要加入外源前体完成新衍生物合成的突变株。 营养缺陷型+独需型：双重阻断突变株 图7-17,突变生物合成的基本流程,利用MBS技术制备新衍生物包括： 突变株的获得； 突变合成元(结构类似物）的获得； 添加的突变合成元被细胞吸收并参与新衍生物合成。 后续工作：包括新衍生物的分离和结构鉴定，以及生物活性评价,利用MBS技术对氨基糖苷类抗生素进行改造，获得成功，特别是涉

13、及2-脱氧链霉胺(DOS)独需型阻断突变株的研究 如7O年代通过诱变获得庆大霉素产生菌绛红色小单孢菌D-突变株后，添加链霉胺，生成2-OH-庆大霉素，毒性低，在临床上被广泛使用 表7-7,JIM-121 JIM202 JI-20A SISO GMc1 GMc2b 2-DOS GMCX2 b c a G418 JI-20B GMC2 GMC1 JM401,小诺米星,西索米星,庆大霉素,依替米星(半合成）,2-脱氧链霉胺,链霉胺,2-OH-庆大霉素,乙基化,庆大霉素1967-1985 8O年代通过诱变获得a位点阻断的突变株JIM-401，该突变株代谢产物中庆大霉素C2b组分即小诺米星的产量大大提高

14、，并实现工业化生产； 再以JIM-401为出发菌株，获得c位点阻断的突变株JIM-202，该突变株的代谢产物中庆大霉素的积累量大大增加(含量在85%以上)，在其2-脱氧链霉胺1-N位引入一个乙基，经半合成获得新化合物1-N-乙基庆大霉素C1a(etimicin，依替米星)； 再以JIM-202为出发菌株，获得b位点阻断的突变株JIM121，其代谢产物中西索米星(sisomicin)组分的产量大大增加,（二）杂合生物合成,采用酶抑制阻断生物合成途径的某一步骤，抑制前体物生物合成，然后再添加另外一些前体化合物，形成新的抗生素。 与突变生物合成的区别是采用酶抑制剂进行阻断。 浅蓝霉素：乙酰-ACP和

15、丙酰ACP聚合酶抑制剂，抑制脂肪酸和聚烯酮，该途径的抗生素合成被抑制,（三）组合生物合成,组合不同的生物合成途径，让菌种合成全新的类似物 结构不同但生物合成途径相似的抗生素生物合成基因之间可以进行重组、组合或互补产生新结构的化合物，在微生物次级代谢产物合成基因和酶学研究基础上形成的。 多基因间接产物。由多基因编码的多酶体系介导而合成的小分子化合物和多肽，包括自然界由微生物和植物产生的天然产物，如抗生素、生理活性物质或萜类化合物等结构比较复杂的化合物。,抗肿瘤作用的阿霉素、紫杉醇，免疫抑制作用的FK506、西莫罗司，降血酯作用的洛伐他汀、银杏内酯，抗结核的利福霉素，抗疟药物青蒿素等。,1985年

16、，Hopwood等将放线紫红素的生物合成基因转入榴菌素和麦德霉素产生菌获得杂合抗生素，标志着微生物次级代谢产物组合生物合成技术的诞生，即通过将不同次级代谢产物合成基因在微生物间的相互交换产生非天然的基因组合，从而人为定向设计具有新结构的次级代谢产物的遗传操作过程。,2.组合生物合成的设计 类PKS主要由酮基合成酶（KS）、酰基转移酶(AT)、脱氢酶(DH)、烯酰还原酶(ER)和酰基载体蛋白(ACP)等功能域组成。KS、AT、ACP是链延伸反应的“最小PKS”，延伸完成的长链由硫酯酶(TE)功能域催化环化成红霉素的前体6-脱氧红霉内酯B(6-DEB)； 类PKS是含有一组可重复使用单元的多酶复合

17、体，其催化链的延伸使之成为一个很长的中间体，然后通过区域专一性的催化形成芳香族聚酮化合物，如四环霉素；,（四）产生杂合抗生素,.生物合成途径中某个酶基因的突变； （1） 6-脱氧红霉素A 将质粒定向插入Saccharopolyspora eryfhraea的编码红霉素合成途径中第一个酶 reyF 基因中 使该菌合成一种新的抗生素 6-脱氧红霉素A 在胃中低 pH 中比合霉素稳定,.在生物合成途径中引入一个酶基因； 中国医学科学院药物生物技术研究所研究开发的必特螺旋霉素(在螺旋霉素产生菌中整合有异源酰化酶基因)，已进入市场，这是迄今为止，国内外惟一一个实现产业化的利用基因工程技术获得的“杂合抗生

18、素”。,.利用底物特异性不强的酶催化形成新产物。 异青霉素合成酶（N）基因pcb，工程菌生产 转化,四、代谢工程,代谢工程(metabolic engineering)或途径工程 (pathway engineering) 利用基因工程技术，定向改造细胞代谢途径，并与基因调控、代谢调控结合，构建新的代谢途径 改变微生物的特性,(一 )改变代谢流 指改变分支代谢途径的流向，阻断其他有害代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的 1. 加速限速反应 增加限速酶的拷贝,原理： Ea Eb Ec Ed A B C D E ( 代谢产物） 限速酶 Rate-limiting Bottleneck Ea E

19、b Ec 起始原料 ACV三肽 异青霉素N 青霉素 -aminoadipic acid L-cysteine L-valine,Ea: ACV合成酶 Eb:异青霉素N合成酶 Ec:异青霉素N酰基水解酶,增加IPNS基因提高青霉素产量,转化青霉素产生菌 Wis54-1255,转化菌株 青霉素V产量提高40%,头孢菌素C生物合成的限速酶,青霉素N是头胞霉素合成的中间体，用顶头孢发酵时发现青霉素N的积累。下一步的乙酰氧基头胞霉素C合成酶是限速酶 克隆了这个酶的基因（cefEF），并转化到顶头孢中 使头孢菌素C的产量提高25-50%，积累的青霉素N消失。,增加限速酶基因提高头孢菌素C产量,转化C.ac

20、remonium394-4,转化后菌株 头孢菌素C产量提高25-50%,例3. 十一烷基灵菌红素 产生菌:天蓝色链霉菌 S.colicolorA3(2),acetyl CoA polyketide pathway,氧甲基转移酶,S-腺苷甲硫氨酸,构建重组质粒(带甲氧基转移酶) 转化到氧甲基转移酶缺陷变株 转化菌株 十一烷基灵菌红素产量提高5倍,抗癌,例4. 泰洛星 (Tylosin) 产生菌:弗氏链霉菌 (S.fradiae),acetyl CoA + malonyl CoA polyketide pathway 大菌素（macrocin) 甲氧基转移酶 Tylosin,构建重组质粒(带甲氧基

21、转移酶) 转化到弗氏链霉菌 (S.fradiae) 转化菌株 泰洛星 (Tylosin) 产量显著提高,十六元大环内酯抗生素,2.改变分支代谢途径流向,提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占优势 提高目的产物支路的酶活性，占据优势、提高产量 在lys合成中，选育出解除了反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了lys产量 获得苏氨酸高产菌株,1.建立苏氨酸工程菌株 以缺失菌为受体，转入高丝氨酸脱氢酶基因，提高了苏氨产量酸 .建立色氨酸工程菌株 克隆-色氨酸合成酶基因，转入邻氨基苯甲酸突变株AJ12264中,3.构建代谢旁路,大肠杆菌糖代谢的末端产物乙酸达到一

22、定浓度时会对细胞的生长产生抑制作用。 将抑制物分解或转化成影响小的其他物质；如：乙酸乙醇（乳酸）。 工业控制：糖流加速度，溶氧等 代谢工程：将枯草杆菌乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌，构建新的代谢支路，使大肠杆菌中乙酸浓度保持在不引起细胞中毒的浓度以下,4.改变能量代谢途径,除代谢途径的基因操作，还可通过能量代谢途径和电子传递系统等间接途径改变代谢流 不直接作用于合成途径，而在限氧条件下提高ATP产率、碳源转化率 将血红蛋白（VHb）基因克隆到酿酒酵母细胞中 表达的血红蛋白活跃了氧化还原过程的电子传递链 间接影响了线粒体的乙醛歧化途径（产生乙醇） 显著提高了乙醇产量,（二）扩展代谢途径,扩展代

23、谢途径是指在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物。如：2-KLG合成。 或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。如：啤酒酵母淀粉产乙醇。 在宿主菌中克隆、表达外源基因改变代谢调控使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物，延长代谢途径，生产新的代谢物，提高产率，利用新底物，改变蛋白质的性质等。,化学转化：将维生素C前体2-KLG为维生素C， 常采用碱转化法。最早的方法,例：VC生产,我国在世界范围内首创的二步发酵生产维生索c新工艺。 第一步：黑醋酸菌发酵，D-山梨醇转化L-山梨糖。 第二步：氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌混合培养。L-山梨糖生成2

24、-酮基-L-古龙酸（2-KLG） 8%左右,我国向国际市场大量出口维生素C后，世界两大维生素C生产国美国和瑞士曾经多次向我国竟价购买这一专利。 我国政府没有同意向它们出售这一专利，但我国某学报却刊载了这项专利的全部研制过程，连配方和剂量都全盘托出，结果使它们的维生素C企业在生产工艺上迅速地赶上,之后改良两步法 草生欧文氏菌将葡萄糖氧化成2,5-DKG 棒状杆菌继续发酵成2-KLG 草生欧文氏菌 棒状杆菌 葡萄糖 2,5-DKG 2-KLG VC,一步发酵法：代谢工程改造 棒状杆菌的2.5-DKG还原酶（2.5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶）基因克隆到草生欧文氏菌中，结果构建成的“VC工程菌”一步

25、发酵直接由D-葡萄糖转化成维生素C前体2-KLG（2-酮基-L-古龙酸），再经酸或碱催化生成维生素C。 但产量不高,2-KLG被宿主内源性的2-酮基醛酸还原酶转化为艾杜糖酸 将草生欧文氏菌染色体上的2-酮基醛酸还原酶基因缺失失活，2-KLG产量大大提高,（三）转移或构建新的代谢途径,将催化一系列生物反应的多个酶基因克隆到不能产生某种新的化学结构的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力。（建路） 克隆少数基因，使原来无关连的两条代谢途径联系起来，形成新的途径，合成新的产物。（连路） 将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一微生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。（改路）,第六节、发酵工程在制药工业

26、中的应用,一、抗生素的发酵生产 青霉素生产:中国为青霉素生产大国，国内生产的青霉素，已接近世界产量的70%，国内较大规模的生产企业有华药、哈医药、石药、鲁抗，单个发酵罐规模均在100 m3以上 自2005年，国际制药巨头相继退出青霉素生产，青霉素生产已经成为中国制药的标志,1.种子（产黄青霉） 深层培养中菌丝形态为球状和丝状两种，我国生产上采用的是丝状菌 沙土管 斜面 孢子悬液 大米固体培养基 大米孢子 大米孢子 种子罐 繁殖罐,青霉素发酵,2.培养基,（1）碳源：乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。目前采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。 （2）氮源：玉米浆含有多种氨基酸

27、及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。补加无机氮源。 （3）前体：苯乙酸及其衍生物均可直接掺入青霉素分子中。浓度大于0.1有毒性。流加低浓度前体。 （4）无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁有毒。,发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4，0.8% 轻质碳酸钙1%,发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%补加硫酸、前体等,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,青霉素采用三级发酵,一级种子发酵：发芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。充分搅拌300-350r/min；

28、40-50 h；pH自然，温度271。 二级发酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。1：11.5；250280r/min；pH自然，251；0-14h。 三级发酵罐：生产罐。花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。,3.培养条件控制,青霉素发酵中采用分批补料法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。 （1）加糖控制 葡萄糖浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，浓度根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。 （2）补前体 （3）pH控制 前期控制在5.7-6.3，中后期6.3-6

29、.6，补加氨水调节。pH低时，加CaCO3、通氨或提高通气量。pH上升时，加糖或天然油脂。,（4）温度 前期控制25-26左右，后期降温控制23。过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。 （5）通气与搅拌 通气比一般为1：0.8。溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥。根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。 （6）消沫 发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。,二、氨基酸生产,提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 酶法：利用微生物

30、细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 发酵法：,谷氨酸生产工艺,工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 1957年，日本采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 目前世界产谷氨酸钠30吨/年，占氨基酸总量的2/3。 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。,选择细胞膜通透较强，在细胞内不积累谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌做菌种,豆饼的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等（）,菌种,发酵罐,灭菌、冷却,谷氨酸,条件控制,加工,产品,天然液体培

31、养基,Na2CO3溶液中和、过虑、浓缩、离心分离等,温度、pH、时间、氧气,谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌,（一）生产菌 棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。,（二）发酵工艺,1.斜面种子培养：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h。 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32培养12h。 二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32进行通气搅拌7

32、-10h。,3.发酵,（1）适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。 2-4h。 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 （2）对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30-32,（3）菌体生长停止期：谷氨酸合成。 措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量 通气，控制温度34-37。 （4）发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 发酵周期一

33、般为30h。,4.谷氨酸发酵控制,（1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，你谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。,（2）种龄和种量的控制 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。 种量为1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。 （3）pH。 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。 谷氨酸脱氢酶最适p

34、H为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。,（4）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。,5.提取,（1）等电点法：操作简单，收率60。周期长，占地面积大。 （2）离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。,赖氨酸（2，6-二氨基己酸）,赖氨酸现已成为世界上第二大氨基酸工业（仅次于味精）

35、。 主要生产企业有美国的ADM；日本的味之素，协合发酵；以上3家占世界总生产能力的80，我国L-赖氨酸的生产能力可达6万t左右，但仍将低于需求量。,氨基酸工业现状,生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品, 主

36、要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。 目前,世界氨基酸产值达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。,三、维生素生产,B2：国内约有l0家生产商。 生产菌有细菌、真菌和霉菌，主要工业生产菌种为阿氏假囊酵母 二级发酵，发酵液先沉淀再氧化进行分离提纯。 发酵培养基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作为碳源，豆油对维生素B2产量显著促进，有机氮源以蛋白胨、骨胶、鱼粉、玉米浆为主。 种子扩大培养和发酵的通气量要求均比较高，通气比一般在1.0，罐压0.05 MPa左右，搅拌功率要求比较高。,阿舒假囊酵母的最适生长温度在28

37、-30，种子培养34-38h后接入发酵罐，发酵培养40h后开始连续流加补糖，发酵液的pH值控制在5.4-6.2,发酵周期为150-160h。维生素B2的产量在50 g/L左右。 分离提取与纯化：发酵液酸化后加热,然后加入黄血盐、硫酸锌沉淀蛋白，过滤后滤液调pH 1.5-2.0酸化，静置20-40h沉淀，压滤后将沉淀物酸溶，加入硝酸铵，氧化抽提，氧化液经结晶、过滤后，湿晶在80 以下干燥20h，得到成品。,VC主要生产商：华药集团、石药集团、东北制药总厂、江山制药厂这4大家族，占全球市场近30-50% 。 全球维生素领域，中企曾具市场垄断地位，彻底击垮了跨国巨头。早前罗氏、日本武田等VC国际巨头不得不将这个产品关门停产， VC市场被中国企业垄断了。 目前， VC市场三足鼎立，即罗氏公司（40%）、巴斯夫公司（兼并武田28%）和中国4家公司,第十节、发酵工程发展展望,紫杉醇的微生物合成,天然红豆杉树皮. 1993年，植物内生真菌（安德烈紫杉菌）通过发酵也能产生紫杉醇，该菌株连3周内发酵液中