动物传染病学：实验六 伪狂犬病抗体检测

1、实验六 伪狂犬病抗体检测（阻断ELISA),酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA),将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。,一、实验目的,掌握ELISA的原理和类型。 掌握阻断ELISA操作程序和结果判定的方法。,二、实验原理,抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； 抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深

2、浅判定抗原抗体反应的发生与否。,间接法（Indirect ELISA） 阻断法（Block ELISA) 双抗体夹心法（Sandwich ELISA) 竞争法（Competitive ELISA),（1）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量抗体量。,显色,间接ELISA,（2）阻断法测定抗体 A.将抗原吸附在固相载体表面; B. 先加待检血清（抗体）, 形成抗原-抗体复合物; C.再加酶标单抗(二抗)； D. 加底物。,酶标单抗,阻断ELISA,（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固

3、相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。,（4）竞争法测定抗原 A. 抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,酶标板，酶标仪 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 猪伪狂犬病毒（PRV） 抗原 样品稀释液： pH7.4 PBS,三、实验材料,阴性对照（EP管中，已稀释） 阳性对照（EP管中，已稀释） 样品 待测猪血清（EP管中，已稀释） 碱性磷酸酶标记猪PRV单抗 酶标单抗（EP管中，已稀释） 洗涤液：含

4、0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（青瓶）,常用酶及底物,底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制 终止液,1.抗原处理：,2.抗原包被：,四、实验方法,3.加待测血清：,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,待测,阳性,待测,4.加单抗：,37，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标单抗100L/孔,37，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色

5、，10min,加终止液1滴,6.观察结果,取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100l，置37温育30分钟。 洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。 每孔加酶标单抗100l，置37温育30分钟。 洗板：同步骤2。 显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50l)，混匀，室温（18-25 ）避光显色10分钟后。 终止：每孔加终止液1滴(50l) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。 结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差0.4。 S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值0.6，样品判定为PRV抗体阳性; 如果S/N比值0.7但 0.6，样品可疑; 如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性。,五、结果与分析,阴阳性对照样品的OD630 ? S/N?，被检血清是阴/阳性？ 结果与预期的不符，可能的原因是什么？,预期结果,阳性：无色 阴性：蓝色,1 2 3 4,阳性,阳性,阴性,被检,被检,？,？,ELISA前血清样品56灭活30分钟。 在ELISA的整个操作过程中，洗涤非常重要,应该用力力甩干,以除去未结合的抗原、抗体和酶标抗体 。 加入底物液