分子生物学-14-真核调控-2-反式因子

1、,第08章 真核生物基因表达的调控 (Eukaryotic Gene Expression ),8.2.3 反式作用因子,是指调节一个基因表达的另一个基因的表达产物（蛋白质或者RNA），能识别或者结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质 反式作用： 一个基因的产物控制另一个基因的表达的过程，称为反式作用， 要通过基因产物其合成的场所扩散到其发挥作用的另一个场所的 因此反式作用因子的编码基因与其识别或者结合的靶DNA序列一般不在同一个DNA分子上。,基本概念,Page306,1.基础转录因子 2.转录调节因子 转录激活因子 转录阻遏因子 3.共调节因子,反式因子根据作用的

2、方式分为三类：page306,转录因子,转录因子（Transcription factor）,是指能够直接或者间接结合在基因上游顺式作用元件的反式作用因子，这些蛋白质能调控其基因的转录。转录因子可以调控核糖核酸聚合酶（RNA聚合酶，或叫RNA合成酶）与DNA模板的结合。 转录因子不单与基因上游的启动子区域结合，也可以和其它转录因子形成转录因子复合体来影响基因的转录。,1.基础转录因子：basal factor 和RNA聚合酶一起结合于转录起始位点和TATA框，组成转录基本复合物(往往参与RNA聚合酶亚基)，无基因特异性 2.转录调节因子：activator 特异性地识别短的共有序列元件的转录因

3、子，结合于启动子或增强子位点上。通过增加转录基本复合物结合于启动子的效率而起作用，因而增加了转录频率 组成型：使基因持续表达 诱导型：在特定的组织和特定时间被激活或合成，结合于应答元件 3.共调节因子：Coactivators 辅助，自身不和DNA结合，连接转录激活因子和转录基本复合物,反式因子根据作用的细胞特异性分为二类：,通用转录因子：各类细胞普遍存在的转录因子。 如TATA box结合因子 TFIID、 GC box结合因子SP1 CAAT box结合因子CTF（CAAT box transcription factor ）。,组织特异性转录因子:与基因表达的组织特异性有很大关系。,8.

4、1.3.4反式因子根据作用的序列相似性和三级结构分为5超类、20多个类，10几个超家族和几十个家族,Transcription factors are often classified based on the sequence similarity and hence the tertiary structure of their DNA-binding domains: 1 Superclass: Basic Domains (Basic-helix-loop-helix) 1.1 Class: Leucine zipper factors (bZIP) 1.1.1 Family: AP-

5、1(-like) components; includes (c-Fos/c-Jun) 1.1.2 Family: CREB 1.1.3 Family: C/EBP-like factors 1.1.4 Family: bZIP / PAR 1.1.5 Family: Plant G-box binding factors 1.1.6 Family: ZIP only 1.2 Class: Helix-loop-helix factors (bHLH) 1.2.1 Family: Ubiquitous (class A) factors 1.2.2 Family: Myogenic trans

6、cription factors (MyoD) 1.2.3 Family: Achaete-Scute 1.2.4 Family: Tal/Twist/Atonal/Hen 1.3 Class: Helix-loop-helix / leucine zipper factors (bHLH-ZIP) 1.3.1 Family: Ubiquitous bHLH-ZIP factors; includes USF (USF1, USF2); SREBP (SREBP) 1.3.2 Family: Cell-cycle controlling factors; includes c-Myc 1.4

7、Class: NF-1 1.4.1 Family: NF-1 (A, B, C, X) 1.5 Class: RF-X 1.5.1 Family: RF-X (1, 2, 3, 4, 5, ANK) 1.6 Class: bHSH 2 Superclass: Zinc-coordinating DNA-binding domains 2.1 Class: Cys4 zinc finger of nuclear receptor type 2.1.1 Family: Steroid hormone receptors 2.1.2 Family: Thyroid hormone receptor-

8、like factors 2.2 Class: diverse Cys4 zinc fingers 2.2.1 Family: GATA-Factors 2.3 Class: Cys2His2 zinc finger domain 2.3.1 Family: Ubiquitous factors, includes TFIIIA, Sp1 2.3.2 Family: Developmental / cell cycle regulators; includes Krppel 2.3.4 Family: Large factors with NF-6B-like binding properti

9、es 2.4 Class: Cys6 cysteine-zinc cluster 2.5 Class: Zinc fingers of alternating composition 3 Superclass: Helix-turn-helix 3.1 Class: Homeo domain 3.1.1 Family: Homeo domain only; includes Ubx 3.1.2 Family: POU domain factors; includes Oct 3.1.3 Family: Homeo domain with LIM region 3.1.4 Family: hom

10、eo domain plus zinc finger motifs 3.2 Class: Paired box 3.2.1 Family: Paired plus homeo domain 3.2.2 Family: Paired domain only 3.3 Class: Fork head / winged helix 3.3.1 Family: Developmental regulators; includes forkhead 3.3.2 Family: Tissue-specific regulators 3.3.3 Family: Cell-cycle controlling

11、factors 3.3.0 Family: Other regulators 3.4 Class: Heat Shock Factors 3.4.1 Family: HSF 3.5 Class: Tryptophan clusters 3.5.1 Family: Myb 3.5.2 Family: Ets-type 3.5.3 Family: Interferon regulatory factors 3.6 Class: TEA ( transcriptional enhancer factor) domain 3.6.1 Family: TEA (TEAD1, TEAD2, TEAD3,

12、TEAD4) 4 Superclass: beta-Scaffold Factors with Minor Groove Contacts 4.1 Class: RHR (Rel homology region) 4.1.1 Family: Rel/ankyrin; NF-kappaB 4.1.2 Family: ankyrin only 4.1.3 Family: NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) (NFATC1, NFATC2, NFATC3) 4.2 Class: STAT 4.2.1 Family: STAT 4.3 Class: p

13、53 4.3.1 Family: p53 4.4 Class: MADS box 4.4.1 Family: Regulators of differentiation; includes (Mef2) 4.4.2 Family: Responders to external signals, SRF (serum response factor) (SRF) 4.5 Class: beta-Barrel alpha-helix transcription factors 4.6 Class: TATA binding proteins 4.6.1 Family: TBP 4.7.1 Fami

14、ly: SOX genes, SRY 4.7.2 Family: TCF-1 (TCF1) 4.7.3 Family: HMG2-related, SSRP1 4.7.5 Family: MATA 4.8 Class: Heteromeric CCAAT factors 4.8.1 Family: Heteromeric CCAAT factors 4.9 Class: Grainyhead 4.9.1 Family: Grainyhead 4.10 Class: Cold-shock domain factors 4.10.1 Family: csd 4.11 Class: Runt 4.1

15、1.1 Family: Runt 0 Superclass: Other Transcription Factors 0.1 Class: Copper fist proteins 0.2 Class: HMGI(Y) (HMGA1) 0.2.1 Family: HMGI(Y) 0.3 Class: Pocket domain 0.4 Class: E1A-like factors 0.5 Class: AP2/EREBP-related factors 0.5.1 Family: AP2 0.5.2 Family: EREBP 0.5.3 Superfamily: AP2/B3 0.5.3.

16、1 Family: ARF 0.5.3.2 Family: ABI 0.5.3.3 Family: RAV,反式因子与顺式元件的作用方式 往往以成环、扭曲、滑动、Oozing（渗透？）等形式通过以下4种方式实现对顺式元件的调控 表达式调节（蛋白质合成） 共价修饰（磷酸化、去磷酸化） 配体结合 蛋白质相互作用,Page307图8-13,反式作用因子的组合式调控作用(conbinatorial gene regulation) 多种反式作用因子通过不同的组合可以调控不同基因的表达。比如上游启动子元件结合蛋白与启动子结合蛋白共同作用调控基因表达 通过组合式调控作用，使得相关蛋白质发生磷酸化/去磷酸化

17、/或者发生配体-受体结合/或者发生蛋白质更替等，从而实现多种反式作用因子的活性调节,转录因子一般有不同的功能区域， 如DNA结合结构域与效应结构域。,反式作用因子一般有两种独立的活性: 特异地与DNA结合位点相结合活性和激活转录的活性。 两种活性可以独立分配给特定的蛋白结构域，分别称作DNA结合结构域和激活结构域，两者是相分离的。 它们在蛋白质的不同区域。,转录因子的结构域,TF,DNA结合域 DNA-binding domain (BD), 转录活化域 Trans-activating domain (AD), 蛋白质-蛋白质结合域， 抑制域（repression domain）， 核定位信

18、号（nuclear localization signals，NLS），信号检测结构域（signal sensing domain）， 二聚化结构域,Transcription factors are modular in structure and contain the following domains: DNA-binding domain (DBD), which attach to specific sequences of DNA (enhancer or promoter sequences) adjacent to regulated genes. DNA sequences

19、 which bind transcription factors are often referred to as response elements. Trans-activating domain (TAD), which contain binding sites for other proteins such as transcription coregulators. These binding sites are frequently referred to as activation functions (AFs). An optional signal sensing dom

20、ain (SSD信号检测结构域) (e.g., a ligand binding domain), which senses external signals and in response transmit these signals to the rest of the transcription complex resulting in up or down regulation of gene expression. Alternatively the DBD and signal sensing domains may reside on separate proteins that

21、 associate within the transcription complex to regulate gene expression.,DNA结合结构域,转录激活结构域,反式作用因子通常具有两个保守的基序：有两种独立的活性,1、 DNA结合结构域（识别或结合） （DNA binding domains） 目前发现14种 2、转录激活结构域 （transcription activation domains） 目前发现4种,1、Helix-turn-helix,螺旋-转角-螺旋： 是最早发现于原核生物中， 结构域长约20aa， 两个-螺旋区和转角。 其中的一个为识别螺旋区， 带有数个直

22、接与DNA序列相识别的氨基酸，定位于DNA大沟， 另一个螺旋与DNA骨架接触,1、 DNA结合结构域基序,常结合CAAT盒,注意箭头,通过这些氨基酸残基的氢键供体/受体 与DNA大沟中的氢键受体/供体发生作用,Helix-turn-helix,In particular, recognition and binding to DNA is done by the two helices, one occupying the N-terminal end of the motif, the other at the C-terminus. In most cases, such as in th

23、e Cro repressor, the second helix contributes most to DNA recognition, and hence it is often called the recognition helix. It binds to the major groove of DNA through a series of hydrogen bonds and various Van der Waals interactions with exposed bases. The other helix stabilizes the interaction betw

24、een protein and DNA, but does not play a particularly strong role in its recognition.,在Helix-turn-helix，HTH中有一类典型的结构叫“同源域”,同源域是一种典型的HTH结构,同源异形基因是决定果蝇体节形成的发育基因,在进化上极为保守，从低等到高等动物都有。编码的蛋白质为同源异形蛋白。 比如果蝇的en，ftz，ubx,补充资料,补充资料,Homeodomain,同源域蛋白Homeodomain Proteins最早从果蝇中克隆自控制躯体发育的基因， 具有60个左右的保守氨基酸序列。后来泛指具有高

25、度同源氨基酸序列的转录因子（同源域），其DNA结合区与 helix-turn-helix motif相似。,补充资料,The homeodomain of the Engrailed protein binds to a particular site in the DNA. Helix 3 contacts the base pairs in the major groove, while the amino-terminal portion of the homeodomain enters the minor groove. (After Pabo and Sauer 1992.) En

26、grailed蛋白是深度保留的转录因子，涉及节肢动物形体的形成,果蝇Engrailed蛋白就属于同源域蛋白,补充资料,The domains of POU family transcription factors,POU同源域蛋白POU Transcription Factors,补充资料,POU同源域蛋白含有两个保守的亚结构域以及它们之间有变化的连接区. 两个亚结构域与DNA相互作用，在连接区可塑性和辅因子的帮助下，POU蛋白作为调控因子和转录因子，显示出DNA结合和识别能力. 在脊椎动物和无脊椎动物中，POU蛋白参与胚胎发生的早期过程，在细胞谱系的分化和神经发育中起调控作用.,补充资料,T

27、he acronym POU is derived from the names of three transcription factors: the Pituitary-specific Pit-1垂体特异的 the Octamer transcription factor proteins Oct-1 and Oct-2 (octamer sequence is ATGCAAAT) the neural Unc-86 transcription factor from Caenorhabditis elegans.,补充资料,同源域结构中的保守序列,补充资料,2、Zinc Finger,

28、1、 DNA结合结构域基序,锌指 Zinc finger: 约30个aa组成，其中4个残基（4个cys,或两个cys两个his)与一个Zn2+配位，分别称为 cys-cys锌指和cys-his锌指 锌指共有序列为： Cys-X24 -Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His 锌指本身包含23个氨基酸，锌指间有7-8个氨基酸残基相连。,与Zinc结合后锌指结构较稳定,常结合GC盒,1、 DNA结合结构域基序,三个锌指的蛋白和DNA结合的晶体结构示意图： 每个锌指的N端形成折叠，C端形成螺旋 三个螺旋恰好等于DNA大沟的一圈,Cys2 / Cy s2锌指,Cys2 / His

29、2锌指,见于甾体激素受体,见于SP1，TF A等,His,Cys,Cys,Cartoon representation of the zinc-finger motif of proteins. The zinc ion (green) is coordinated by two histidine and two cysteine amino acid residues. Based on the X-ray structure of PDB 1A1L.,Cartoon representation of the protein Zif268 (blue) containing three

30、zinc fingers in complex with DNA (orange). The coordinating amino acid residues of the middle zinc ion (green) are highlighted.,转录因子SP1 （能够集合于DNA启动子上游结构的GC盒） 连续的3个锌指重复结构。,两个单体通过锌离子稳定折叠成更复杂的构象，再把每个单体的-螺旋插入到DNA的连续大沟中,接触空间小,转录因子TFIII的锌指结构,转录因子TFIII分子结构上有9个锌指结构域可以插入到DNA的大沟中,1,2,3,4,5,6,7,8,9,N,C,锌指,DNA结

31、合 结构域,转录激活 结构域,锌指其实是这个转录因子的DNA结合结构域，而转录激活结构域则位于其两侧的主链上,大沟,小沟,转录激活 结构域,锌指结构,Functional domains of zinc finger transcription factors. Cysteine (C) and histidine (H) coodinate a zinc atom, causing the looping out of the zinc fingers,转录激活 结构域,DNA结合,蛋白质主链,锌指其实是这个转录因子的一个结构域，尤其是指DNA结合结构域，而转录激活结构域则位于主链上,锌指核

32、酸酶介导的基因打靶（ZFN技术）,人工突变的锌指蛋白的每个锌指可以识别特定的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。多个锌指串联起来就可以识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性。 把锌指蛋白与来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶FokI融合在一起就形成了锌指核酸酶ZFN，可以用来进行基因修饰，比如基因打靶、基因敲除等，从而用于临床的基因治疗。,祝福你,Zinc-finger nuclease,每个锌指识别一个三联体,注意：page312图8-18，有误：不明不白,交错切割位点,锌指核酸酶介导的基因打靶（ZFN技术）,祝福你,锌指核酸酶介导的基因打靶（ZFN技术）,祝福你,实现单个氨基

33、酸突变,ZFN技术祝福你技术背后的故事,技术垄断 临床利益 反垄断,ZFN技术的改进-TALEN技术,顺式元件与反式因子作用的分子本质是特异的氨基酸（序列）与特定的碱基（序列）相互识别并且结合,注意page315图8-23，不明不白，方块中漏印了太多的东西,转录激活子类似蛋白效应因子（Transcription Activator-Like Protein Effector, TALE）是黄单胞菌属病原菌分泌到宿主植物细胞中的一种毒性蛋白，可以识别植物DNA，驱动基因表达。 TALE 蛋白中部的一段串联重复序列具有与目标DNA 序列特异识别及结合的能力， 串联重复序列由33-35 个氨基酸残基

34、构成， 不同的TALE 蛋白的串联重复序列不同，是因为其中第12、13 位的氨基酸残基在不同重复单元中为可变氨基酸残基，被称为RVD（repeat-variable di-residue）。 不同RVD 组合特异性地对应一个核苷酸 最为常见的编码方式为： NG （ Asn Gly） T、 HD（His Asp ）C、NI（Asn Ile ）A、NN （ Asn Asn ） G。,TALEN 技术,TALEN 技术,这种氨基酸与核苷酸的一一对应关系，提供了一种思路，成功解决了ZFN 方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响的问题，使目标基因定向修饰变得简单可行。 2010

35、年，由美国Daniel Voytas 首先将其应用于靶向核酸酶构建中，将TALE 的DNA 结合相关结构域与FokI 的核 酸酶结构域融合，获得了针对特定DNA 序列具有特异切割活性的靶向核酸酶TALEN（transcription activator-like effectors nuclease）。 应用TALEN 技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在目标生物基因组靶向性引入DNA 双链断裂，进而依靠细胞内源DNA 修复机制，实现目标位点的定向修饰，如Knock-out、Knock-in 及Replacement等。,NN,NLS,AD,构建TALEN,体内修复,3、Leucin

36、e zippers,1、 DNA结合结构域基序,亮氨酸拉链：是亲脂性螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。每隔6个残基出现一个亮氨酸。由赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）组成DNA结合区。 一种特殊的螺旋，疏水氨基酸集中排列在螺旋的一侧，疏水表面是两个蛋白质分子构成二聚体的接触点 螺旋的特点是Leu频繁出现，每7个aa残基中出现一个，延螺旋的疏水侧排列成直线 与Leu重复区相邻的是碱性氨基酸含量较高的DNA结合区。形成二聚体时该碱性区对DNA的亲和力较高,亮氨酸之间相互作用形成 二聚体的“拉链” 。 肽链氨基端2030个富含碱性 氨基酸结构域与DNA结合。 这类

37、蛋白质的DNA结合结构域 是以碱性区和亮氨酸拉链结构 域整体作为基础的。,当来自同一个或不同多肽链的两个-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸残基）相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链。,碱性结构域,二聚体结构域,图8-20,leu,leu,疏水区leu相互作用,碱性区 与DNA结合,亮氨酸拉链的肽链上每相隔七个残基就会有一个疏水的亮氨酸残基，这些残基位于DNA结合域的C端-螺旋上，这样-螺旋的侧面每两圈就会出现一个亮氨酸，形成一个疏水的表面。结果在-螺旋的疏水表面间就可以互相作用，形成二聚体。这种相互作用形成一个卷曲的卷曲结构 (coiled-coil structure)。,1、

38、 DNA结合结构域基序,Leucine zippers,肝脏、小肠上皮、脂肪以及某些脑细胞中存在一类C/EBP家族蛋白，GCN4酵母激活因子、CREB（cAMP应答元件结合蛋白）、热休克蛋白原癌基因jun, fos编码产物，它们都具有典型的亮氨酸拉链结构,4、碱性-螺旋-环-螺旋helix-loop-helix,bHLH,二聚体结构域,该调控区长约50个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连， 其DNA结合功能是由helix延伸出来的富碱性氨基酸区所决定的。,helix,loop,Domains of the bas

39、ic helix-loop-helix transcription factors,这一结构在总体上与亮氨酸拉链相似，只是它的二个-螺旋被一个非螺旋的多肽环分成二个单体蛋白，C端-螺旋一侧的疏水残基可以二聚化。与亮氨酸拉链一样，HLH结构也经常与碱性结构域相邻，以形成DNA结合所需的二聚体。,4、basic helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋(HLH) ：该调控区长约4050 个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。 两个螺旋被1024个残基的

40、环隔开 螺旋负责二聚体的形成 HLH基序附近含碱性的DNA结合序列,1、 DNA结合结构域基序,转录激活结构域,一般由20-100个氨基酸残基组成。 如GAL4（the yeast transcription activator protein）分子中有2个这种结构域，分别位于多肽链的第147-196位和第768-881位；GCN4的转录激活结构域位于多肽链的第106-125位。,2、转录激活结构域,（transcription activation domains）,转录激活结构域是反式作用因子必须具备的结构基础。转录活化域通常是依赖于DNA结合结构域以外的30100个氨基酸残基。转录因子通

41、常具有一个以上的转录活化区,Page305,1. 酸性-螺旋(acidic -helix),该结构域含有由酸性氨基酸残基组成的保守序列，多呈带负电荷的亲脂性-螺旋，包含这种结构域的转录因子有GAL4、GCN4、糖皮质激素受体和AP-1/Jun等。 增加激活区的负电荷数能提高激活转录的水平。 可能是通过非特异性的相互作用与转录起始复合物上的TFIID等因子结合生成稳定的转录复合物而促进转录。,2、转录激活结构域,2. 谷氨酰胺丰富区(glutamine-rich domain),SP1的N末端含有2个主要的转录激活区，氨基酸组成中有25%的谷氨酰胺，很少有带电荷的氨基酸残基。 酵母的HAP1、H

42、AP2和GAL2及哺乳动物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有这种结构域。,2、转录激活结构域,3.脯氨酸丰富区(proline-rich domain),CTF家族（包括CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端与其转录激活功能有关，含有20%-30%的脯氨酸残基。,2、转录激活结构域,Pro-rich domain,4.阻抑物结构域(suppressor factor domain),转录的阻抑有可能是通过间接地对激活因子功能的干扰而实现的，有以下几种情况: 阻断了激活因子的DNA结合位点 (与原核生物的阻抑蛋白一样)。 并非阻碍DNA结合而是掩盖了激活结构域。,补充资

43、料,转录调控的对象,DNA结合结构域和转录激活结构域的多样性的存在暗示了在起始转录复合体中不同的反式作用因子的调控对象是不同的： 例1：酸性激活结构域可以从下游的增强子位点激活转录，而富含脯氨酸结构域的激活力很弱，富含谷氨酰氨根本无法激活; 例2：在酵母中富含脯氨酸的结构域和酸性结构域具有活性，而富含谷氨酰胺的结构域则没有活性， 这些都表明激活结构域有不同的调控对象。,补充,补充,不同的转录激活因子调控的对象是不一样的，可能的情况有以下几种: 染色质结构; 与TFD作用; 与TFB作用; 对TFH复合体的调整和作用。 不同的激活结构域有着不同的调控对象，而且转录起始和延伸过程的任何组分或阶段都可能成为调控的对象，从而实现转录的多阶段调控。,补充,1、 CAAT box转录因子 CTF（CAAT box transcription factor）家族是能识别CAAT盒的一组转录因子。 主要有CTF、CP等 这一组因子是由单个基因通过可变剪接而形成的一组mRNA产生的。 CTF家族成员对各种CAAT盒有相同的亲和力。 CP1具有对-球蛋白和腺病毒晚期基因启动子CAAT区的高亲和力， CP2具有对-血纤蛋白原基因启动子CAAT区的高亲和力， CP3能与腺病毒DNA相结合。 CP族蛋白主要以异源多聚体的形式存在。,3. 与已知DNA序列相结合的反式作用因子实例,补充,除了CTF和CP族