分子生物学-03-2-第二章染色体与DNA-3酶学特点基本机理

1、教学单元教案格式4 第二章 染色体与DNA 课程教案授课题目：复制的基本机理和酶学教学时数：2授课类型： 理论课 实践课教学目的、要求：理解：DNA半不连续复制的过程及其意义深入了解：DNA聚合酶的结构深入掌握：复制的原理、过程了解：酶学的特点教学重点：重点阐明：酶学重点指出：复制的方向问题，是如何解决这个问题的教学难点：绝对难点：DNA复制的酶学相对难点：复制的过程的描述教学方法和手段：老师讲授为主：讲授 视频演示 PPT演示 讨论。以电脑幻灯片边演示边讲述为主，（白板课件）辅以板书（黑板板书）学生回答问题为辅：（如时间等条件许可的情况下）注：以下内容按实际需要进行取舍 要求有多媒体，因为信

2、息量大，许多结构图需要媒体放映，效果才好教学内容与教学设计：（第一课时）2.4 DNA复制的基本机理1、DNA复制的基本机理DNA由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基通过A:T和G:C之间的氢键联结在一起。在复制过程中首先两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代的DNA，另一条链则是新

3、合成的。这种复制方式称为半保留复制(semi conservation replication) 谱。2、DNA的复制过程（大肠杆菌为例）1. 双链的解开2. RNA引物的合成3. DNA链的延伸4. 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段3、复制起点DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Origin of replication)，用ori表示复制起点是有特定结构的，不是随机的4、复制子 DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核生物中，每个DNA分子上就有一个复制子;而

4、在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子，每个复制子长约50-200kb。因此，真核细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的。5、大肠杆菌复制起点引发的DNA复制 后面再讲6、复制方向和速度单起点、双向等速 多起点、双向等速7、DNA复制的特点-总结 DNA复制的最主要特点是半保留复制和半不连续复制(Semi-ondisctinuous replication)： DNA 在进行复制的时候一其中的一条链为模板连开始复制，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用复制出新的DNA双螺旋。 子代DNA 其中的一条链是亲代DNA 保留下来的也就是说新合成的DNA 中一条链是新合成的另一

5、条是亲代DNA留下来的。成为半保留复制。 在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是35，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿53方向连续进行，这条链称为前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为53，以此为模板的DNA合成也是沿53方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为滞后链(lagging strand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制

6、和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。8、General features of a replication fork9、与DNA复制有关的物质10类 复习1、底物：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物催化合成DNA反应需要有

7、模板和引物的指导反应需要有3-OH存在,催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端DNA链的合成方向为5 3 6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)： 拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用

8、是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶8、DNA 解螺旋酶 /解链酶（DNA helicase) 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。10、DNA螺旋酶 DNA gyrase回旋酶;促旋酶;旋转酶10、DNA聚合酶详解l 大肠杆菌DNA聚合酶1的理化性质纯化的DNApol由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有

9、一个二硫键和一个-SH基。通过二个酶分子上的-SH基与Hg2+结合产生二聚体，仍有活性。每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子每分钟在37下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为76KD，通常称为Klenow片段，小片段的分子量为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。DNAPol在空间结构上近似球体，直径约650nm。在酶的纵轴上有一个约200nm

10、的深沟(cleft)，带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点:1模板DNA结合位点;2DNA生长链或引物结合位点;3引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3-OH;4脱氧核苷三磷酸结合位点;553外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5-端脱氧核苷酸并切除之;635外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3-端核苷酸。l 大肠杆菌DNA聚合酶I的功能1 聚合作用：在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol I逐个将核苷酸加上去，就是DNApol I的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有

11、催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。 2 35外切酶活性校对作用:这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被35外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种

12、外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，35外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被35外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的35外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，35外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。 3 53外切酶活性切除修复作用:53外切酶活性就是从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧

13、核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端DNA引物的去除也依赖此种外切酶活性。53外切酶活性可以导致三种反应4焦磷酸解作用:DNApol的这种活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。 (dNMP)n+XPPi(dNMP)n-x+X(dNTP)DNA5 焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的P

14、Pi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNAl DNA polymerase III（了解）l11、DNA复制的大致过程： 1、 双链解开2、 引发体形成3、延伸4、 终止 复制的终止比较简单，当复制叉遇到DNA序列上重复出现的终止序列时， 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止） 在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链思考一个问题：方向问题 后随链在DNA聚合酶III上形成了一个回折，从而使后随链与聚合酶的活性位点的结合方向与前导链一致，

15、从而保证了两条链能够使用同一个全酶进行同一方向的复制总结：真核生物中DNA的复制特点？1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。3、真核生物有多种DNA聚合酶。作业布置：1、武汉大学2003年硕士研究生入学分子生物学试题：Replicon、 semi-conservative replication 2、 科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入学试题 原核DNA合成酶中（ ）的主要功能是合成前导链

16、和冈崎片段 A、DNA聚合酶 B、DNA聚合酶 C、DNA聚合酶 D、引物酶 3、 科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入学试题4、 名词解释 ：冈崎片段（3分）5、明DNA是遗传物质的两个关键性实验是：肺炎链球菌在老鼠体内的毒性和T2噬菌体感染大肠杆菌。这两个实验中主要的论点证据是：（ ） (a)从被感染的生物体内重新分离得到DNA，作为疾病的致病剂 (b)DNA突变导致毒性丧失 (c)生物体吸收的外源DNA（而并非蛋白质）改变了其遗传潜能 (d)DNA是不能在生物体间转移的，因此它一定是一种非常保守的分子6、953年Watson和Crick提出：（ ） （a）多核苷酸DNA链通

17、过氢键连接成一个双螺旋 （b）DNA的复制是半保留的，常常形成亲本子代双螺旋杂合链 （c）三个连续的核苷酸代表一个遗传密码 （d）遗传物质通常是DNA 而非RNA 7、列哪一种蛋白不是组蛋白的成分（ ） (a) H1 (b) H2A 、H2B (c) H3、H4 (d) H5 8、NA的变性：（ ） （a）包括双螺旋的解旋 （b）可以由低温产生 （c）是可逆的 （d）是磷酸二酯键的断裂 （e）包括氢键的断裂 9、DNA的二级结构指：（ ）； （a）是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成； （b）是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构；（c）是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。 10、在原核生物复制子中以下哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核甘酸： (A)DNA聚合酶 （B） DNA聚合酶 （C）DNA聚合酶(D)外切核酸酶MFl 11、DNA复制时不需要以下哪种酶？（ ）。（A） DNA指导的DNA聚合酶 （B） RNA指导的DNA聚合酶（C）拓扑异构酶 （D）连接酶 12、DNA复制的特点（ ）。A.半不连续复制 B.半保留复制C.都是等点开始、两条链均连续复制 D.有