枯草芽孢杆菌

1、芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.8 23 微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6 0.9 1.0 1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取 5-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。常用培养基配

2、方：1L 蒸馏水 +10g 蛋白胨 +3g 牛肉膏 +15-20g 琼脂能耐氧化；耐挤压；耐在快速繁殖过程中，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶） 、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，高温，能长期耐60C 高温，在 120C温度下能存活 20 分钟芽孢染色法 是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（ malachite green ）或碱性品红（ basicfuchsin ）在加热条件下进行染色时， 此染料不仅可以进入菌体， 而且也可以进入芽

3、孢， 进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。（ 1） 将培养 24 小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（ 2）滴加 3 5 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（ 3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约45 分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约76）染 10 分钟。（ 4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（ 5）用番红水溶液复染 1 分钟，水洗。（ 6）待干燥后，置

4、油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。】在 pH 为 5.58.5时生长良好，最适生长温度为370一、目的要求1、学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。2、学习噬菌体效价测定的基本方法。二、基本原理因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现奇特异的噬菌体的存在，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌， 故也能很容易的分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。 由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来，所以， （ a）在液体培养基内可使混浊菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存

5、在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养， 使噬菌体增殖、 释放，从而可分离到特异的噬菌体；（b）在宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌而形成透明的空斑，称噬菌体斑（图1），一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体的效价。本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再进一步纯化。噬菌体的效价就是1 毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌体斑，因此，能进行噬菌体的计数。二、器材37

6、培养 18 小时的大肠杆菌斜面，阴沟污水；本实验均用普通肉膏蛋白胨培养基500 毫升三角瓶内装三倍浓缩的液体培养基100 毫升，试管液体培养基，琼脂平板，上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，没管4 毫升），底层琼脂平板（含培养基 10 毫升，琼脂 2%）大肠杆菌 18小时培养液， 大肠杆菌噬菌体 10-2稀释液 （用肉膏蛋白胨液体培养基稀释）含 0.9 毫升液体培养基的小试管 4支，肉膏蛋白胨琼脂平板（ 10 毫升培养基，2 琼脂，作底层平板用），含 4毫升琼脂培养基的试管（ 0.7 琼脂， 作上层培养基用）5 管，灭菌小试管 5支，灭菌 1毫升吸管10 支，48 水浴箱等。灭菌吸管，灭

7、菌玻璃途布器，灭菌蔡氏细菌滤器，灭菌抽滤器，恒温水浴箱，真空泵等。1、 噬菌体的分离（ 1） 制备菌悬液 取大肠杆菌斜面一支，加 4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。（ 2） 增殖培养 于 100ml 三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml 与大肠杆菌悬液2ml ，37培养 12 24 小时。（3） 制备裂解液将以上混合培养液2500r/min离心 15 分钟。 将以灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶，安全瓶再连接于真空泵（如图 2）。图上的真空表接或不接均可。将离心上清夜倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角瓶内

8、，37培养过夜，以作无菌检查。（ 4）确证试验 经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在。（ a）于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。(b)待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，里 37 培养过夜。 如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。2 、噬菌体的纯化（1）如果已证明确有噬菌体的存在，便用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1毫升大肠杆菌悬液，使混合均匀。( 2 ）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48（可预先溶化、冷却，放 48 水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.

9、2毫升，立即混匀。( 3）并立即倒人底层培养基上，混匀。置37 培养 12 小时。( 4 ）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37 培养。（5）等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。（以上（ 1 ) ( 2 ) ( 3）三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌实验的同时，由教师先做顶备试脸，若平板上的噬菌体连成一片，则需减少接种量（少于一环）或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。以免全班同学重做）

10、。3 、高效价噬菌体的制备刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。 将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按 l : 10 的比例混合， 再加入大肠杆菌悬液适量（可与噬菌体滤液等量或1/2的量），培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的噬菌体制品。4、噬菌体是效价测定（1）稀释噬菌体（a）将 4 管含有 0.9毫升液体培养基的试管分别标写10-3 ， 10-4 ，10-5 和 10-6 。(b) 用 1 毫升无菌吸管吸0.1 毫升 10-2 大肠杆菌噬菌体，注入10-3 的试管中，旋摇试管，使混匀。(c) 用另一支无菌吸管从吸 0.1 毫升 10-3 大肠杆菌噬菌体， 注

11、入 10-4 的试管中， 旋摇试管，使混匀。余类推，稀释到 10-6管中，混匀，如图所示。（2) 噬菌体与菌液的混合（a）将 5 支灭菌空试管分别标写10-4 ， 10-5 ， 10-6 ， 10-7和对照( b ）用吸管从10 -3 噬菌体稀释管吸 0.1毫升加人10 -4的空试管内， 用另一支吸管从 10 -4稀释管内吸 0.1毫升 时加人 10-5空试管内，如图1 直至 10 -7 管。( C ）将大肠杆菌培养液摇匀，用吸管取菌液0.9毫升加人对照试管内，再吸0.9 毫升假如 10-7 试管，如此从最后一管加起，直至10-4 管，各管均加 0.9 毫升大肠杆菌培养液。（D）将以上试管旋摇混匀。（1）将 5 管上层培养基融化，标写10-4 ， 10-5 ，10-6 ， 10-7 和对照，使冷却至48，并放入48水浴箱内。（ 2 ）分别将 4 管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合液后，立即旋摇混匀。（ 3）混合液加入上层培养基中（ 4）接种了的上层培养基倒入底层平板上( a ）将旋摇均匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板。( b）凝固后，放置37培养(5)观察平板中的噬菌斑将每个稀释度的噬菌