USP29-1116洁净室和其它受控环境的微生物评估中文稿.doc

1、1 洁净室和其他受控环境的微生物学评估 本章信息旨在综述与散装原料药、剂型以及某些医疗用具无菌操作相关的各种问题；并对控 制环境进行制定、保持和控制其微生物学特性。 本章包括的讨论有关以下方面：(1) 基于颗粒计数限制上的洁净室分级；(2)控制环境的微生 物学评估程序；(3) 人员培训；(4) 设计和实施微生物学评估程序中的关键因素；(5) 取样 策略的制定；(6) 建立微生物警告和行动标准；(7) 应用于微生物取样的方法学和仪器操作； (8) 培养基和稀释剂；(9) 微生物隔离群的鉴别；(10) 经培养基填充的操作评估；以及 (11) 词汇表。本章以外的讨论是有执照药房制备家用无菌产品应用控

2、制环境的问题，其包含在药 用配方无菌制备（Pharmaceutical CompoundingSterile Preparations）797 中。 对于无菌操作的控制环境中微生物状况的控制和评估存在方法选择性。本章中的数字评估并 非有意代表绝对的评估或规范，而仅是一种信息上的表示。考虑到微生物取样设备和方法的 多样性，不能说达到这些值就能保证微生物控制的需求标准，或者与本章这些值有偏差、高 于本章的值就认为是失去控制。微生物取样和分析应用不当，可能会引起显著的差异和不慎 污染的潜在性。本章标明的取样培养基、设备和方法，不是特定的规范而只是一种信息参考。 通过无菌操作可产生高比率的无菌产品。因

3、为无菌操作依赖的是流程中微生物的排除和阻止 包装过程中微生物进入敞口容器，制造环境中的微生物负担和产品的生物负担对于保证这些 产品的无菌水平来说，是相关的重要因素。 洁净室分级的确立 洁净室和控制环境的设计和构建，在联邦标准 209E 中被提及。此空气洁净标准通过空气播 散颗粒绝对浓度定义。其中包括用于控制环境空气级别分配和监测空气播散颗粒的方法。这 一联邦文件仅适用于控制环境内的空气播散颗粒，且并非有意的强调颗粒的活性与非活性属 性特征。 制药工业中的洁净室和其他控制环境的联邦标准 209E 已经被洁净室制造商所采用，以提供 这些设施的组装、试车和维护的规范。然而，制药工业中的有效数据并不能

4、给非活性颗粒数 量和活性微生物浓度之间的关系提供科学的一致性。 2 电子工业的非活性颗粒数量的关键程度使得应用联邦标准 209E 成为必需，虽然制药工业在 与联邦标准中特定的总颗粒相比较而言，更关心的是活性颗粒(即微生物) 。制药行业中对 注射制剂中的总颗粒数有明确规定。(见 注射品中的颗粒物质（Particulate Matter in Injections）788)。 洁净室的颗粒数越少，空气播散微生物的可能性越小。这一理论是经认可的，且能够为制药 生产商和洁净室及受控环境的建造者提供功能设施建造方面的工程学标准。 应用在制药工业的连邦标准 209E，是以所有颗粒大小的限定为依据的，即，大

5、小等于或大 于 0.5 m 的。 表1 描述了联邦标准 209E 适用于制药工业的空气播散颗粒洁净级别。制 药工业适用 M3.5 以及更高级别。M1 级别和 M3 级别相关于电子工业，表 1 所示仅为出 于比较目的。通常认为，假设不存在气流、温度和湿度的改变，则使用中的洁净室或其他控 制环境中存在的颗粒越少，操作条件下的微生物计数将会越少。 洁净室被维持在以动态的 (运作的)数据为根据的操作控制状态下。 表 1. 空气播散颗粒洁净级别* 级别名等于或大于 0.5 m 的颗粒 SIU.S.习惯(m3)(ft3) M1 10.00.283 M1.51 35.31.00 M2 1002.8 M2.5

6、10 35310.0 M3 1,00028.3 M3.5100 3,530100 M4 10,000283 M4.51,000 35,3001,000 M5 100,0002,830 M5.510,000 353,00010,000 M61,000,00028,300 M6.5100,000 3,530,000100,000 M7 10,000,000283,000 * 来自 U.S. 联邦标准 209E, 1992 年 9 月 11 日“洁净室及洁净区内空气播散颗粒洁 净级别。” 控制环境中微生物学评估程序的重要性 监测控制环境中总颗粒计数，甚至应用连续电子仪器计数，仍不能提供关于环境中微生

7、物含 量的信息。颗粒计数器的基本限制在于它们测量颗粒为 0.5 m 或者更大的。而空气播散微 3 生物并不是自由浮动的或是单细胞的，它们经常联合成 10 到 20 m 的颗粒。控制环境中的 颗粒计数和微生物计数是随着取样位置和取样期间采取的活动而改变的。监测环境中的非活 性颗粒和微生物是一项重要的控制措施，因为它们对达到颗粒物质（Particulate Matter）和 注射（Injections）1 条件下无菌（Sterility）的产品要求来说，都是重要的。 控制环境的微生物监测程序应当对人员的以及由人员执行的可能对控制环境造成生物负担影 响的清洁卫生处理的实行以及洁净效应予以评估。不管系

8、统多么复杂，微生物监测将不再、 也不需要对这些控制环境中存在的所有微生物污染进行鉴别和定量。然而，常规的微生物监 测应该提供用以确定控制环境是在适当的控制状态下运作的有效信息。 具备资格人员对环境微生物监测和数据分析，应该在容许洁净室和其他受控环境保持在控制 状态下进行。考虑到有意义数据的收集，则应当在环境正常运行过程中取样。微生物取样应 当发生在原料在场、加工处理在进行中且操作人员在岗时。 适当的时候，洁净室和一些其他控制环境的微生物监测应当包括室内空气以及进入关键区域、 表面、设备、清洁卫生处理容器、地板、墙壁和人员着装(如工作服和手套)的压缩空气的微 生物含量定量。微生物监测程序的目的对

9、环境生物负载来说具有代表性的评估。当数据被收 集和分析时，受过训练的人员应对任何趋势进行评估。尽管以推荐和特定的频率为根据来考 查环境的结果是重要的，可是考查扩展时期的结果对于确认趋势是否为目前的也同样的关键。 趋势可以通过构建包括警告和行动标准的统计检验图表而形象化。控制环境的微生物控制可 以以这些趋势数据为根据，进行部分的评估。应当做定期报告或总结借以警示责任管理人员。 当受控环境中特定微生物水平超标时，应当进行文件性的综述和调查。在调查的细节上可能 会有所不同，这要根据室内制造产品的类型和加工过程的不同来确定。调查应当包括区域维 护文件考查；清洁卫生处理文件；固有物理的或操作的参数，如环

10、境温度和相对湿度的改变； 以及相关人员的培训状况。调查之后，采取的行动可能会包括加强人员培训以强调微生物控 制的重要性；增加频率添加取样；添加清洁卫生处理；添加产品测试；鉴定微生物污染及其 可能来源；如果必要的话，需对现有标准化操作规程进行再评价并使其重新生效。 根据调查综述和结果测试，微生物水平超标的显著性和在那种条件下操作或产品处理的可接 受性可能是需要查明的。任何对于行动过程的调查和理论都应当通过文件证明，且应作为整 个质量管理系统的一部分。 控制环境，如洁净区或洁净室，是依照相关洁净室运行标准证明确定的。评估参数包括过滤 的完整性、空气流速、通风模式、换气以及压力差别。这些参数能够影响

11、洁净室运行中的微 生物生物负载。洁净室的设计、构建以及运行存在多样性，这使得对这些参数的泛化变得 4 困难。 Ljungquist 和 Reinmuller1发展了通过增加邻近关键工作区域和设备的周围粒子浓度 对系统进行颗粒激发测试的方法。首先，烟的产生使得洁净室或一个控制环境的各处空气流 动成为可见。旋涡或紊流区段的存在能够完全可见，且气流模式可以微调到消除或最小化不 良影响的状态。然后，颗粒物质就产生于关键区和无菌区的附近了。此评估是在模拟生产条 件下进行的，但是设备和人员均在场。 在微生物监测程序生效之前，完成适当的测试和优化洁净室或控制环境的物理特征是必要的。 确保适当的控制环境并依照

12、其工程规范运作，将会更高效的确保控制环境中对于无菌操作而 言能有适当的生物负载。在洁净室或受控环境的日常确认过程中，应当重复进行这些测试； 在进行如人员流动、加工过程、操作过程、原料流程、空气处理系统或设备布局等显著性的 操作改变时，也应当重复进行这些测试。 人员的培训 无菌处理产品需要生产商密切关注人员管理的细节，保持严格的纪律以及对其进行严格的监 督，以确保维持适当的环境质量水平，并确保最终产品的无菌性。 对控制环境中工作人员进行培训是个关键。这种培训对微生物监测程序的责任人员同样也是 重要的，因为微生物取样过程如不注意操作，很容易引起洁净工作区域污染的发生。 在高 度自动化的操作中，监测

13、人员可能是加工处理区域内与关键区带有最直接联系的人员。在加 工处理区域内工作前和工作后，都应当对人员进行监督检查。 微生物取样是导致微生物污染的潜在因素，如果取样方法不当，会导致微生物污染的发生。 正式有效的人员培训计划会使这种危险性因素减到最小。这一正式有效培训应当是针对所有 进入受控环境的人员的，并形成文件性规定。 对于设备的管理必须保证洁净室和控制环境内所有的相关操作人员能够很好的精通相关微生 物学原理。培训应当包括无菌处理基本原则以及对产品潜在污染源处理过程的关联训练。此 培训应当包括微生物基本原则、微生物生理学、消毒和卫生、培养基选择和制备、分类学以 及灭菌等指导，这些对涉及无菌操作

14、的人员本身都是必需的。涉及微生物鉴别的人员，还需 要进行实验室所需方法的专业培训。此外，还必须给相关人员提供所收集环境数据的管理方 面的附加培训。对应用标准化操作规程的认识和理解是很关键的，尤其是那些与当环境条件 这样要求时采用的纠偏措施相关的标准操作规程。了解关于生产质量管理规范 (GMPs) 中 每一个体责任以及顺应性调整政策，同指导调研和分析数据的培训一样，都应该作为整体培 训计划的一部分来实行。 5 控制环境中微生物污染的主要污染源是工作人员。微生物可以通过人体传播而引起污染的发 生，尤其是那些处于活动传染期个体。因此控制环境只能准许健康的个体进入。 由这些事实来看，良好的个人卫生以及

15、对个人进入控制环境所用的无菌衣处理过程细节上的 注意都显得十分重要。这些人员一旦穿戴整齐，包括完全的面部覆盖处理，就必须在整个期 间内小心的保持他们手套和制服的完整性。由于无菌处理过程中产品的主要污染威胁来自操 作人员，使得控制与这些人员相关联的微生物污染成为环境控制程序中一个重要的因素。 包括无菌操作在内，对控制环境的工作人员进行彻底的培训是重要的，但是也不能去过分的 强调。因为环境监测程序仅通过自身是无法检测无菌操作的所有对环境微生物品质可能的妥 协事件的。因此，周期性的培养基填充或过程模拟研究，对于使方法重新生效以确保适当的 操纵管理和保持有效培训来说是必需的。 微生物学环境控制程序设计

16、和实施中的关键因素 一项环境控制程序应当具有实时检测微生物状态中逆变的能力，这样才能保证采取有意义并 有效的改善行动。厂商有责任制定、启动、执行这样的环境控制程序并使其成文件性规定。 尽管对于环境控制程序的一般性建议将被讨论，但对于特定设备和特殊条件，仍急需制定这 样的程序。一般的微生物菌株生长培养基，如大豆酪蛋白消化培养基，在大多数情况是适用 的。如果这些环境中使用或应用了消毒剂或抗生素，这种培养基可以通过补充添加剂来克服 消毒剂或抗生素的效应或使其效应最小化。酵母菌和霉菌的检测和定量应当给以考虑。一般 的真菌培养基，如萨布罗氏培养基、改良萨布罗氏培养基或抑制霉菌琼脂，都是可以接受的。 其它

17、已经确证的促进真菌生长的培养基，如大豆-酪蛋白消化琼脂，也可以应用。一般而言， 对于专性厌氧菌，不进行常规的检测。然而，应当有适当的条件或研究做保证，比如无菌试 验装置中这些微生物的频繁检测证明的鉴别等。应当对选择性培养基检测和定量这些厌氧或 微需氧微生物的能力进行评估。 一旦选定适当的培养基，就要进行时间和孵育温度的选择。典型的孵育温度为 22.5 2.5 和 32.5 2.5 ，孵育时间分别为 72 和 48 小时。为环境程序所制备的生长培养基的灭菌过 程应当是有效的，且应当对其进行无菌检测和生长促进检测，详述可见无菌检查 （SterilityTests）71。另外，对于生长促进检测，从控

18、制环境中分离得到具代表性的微生 物群或从 ATCC 菌株制备这些分离菌株也可能用来检测培养基。培养基在接种量小于 100 个菌落形成单位（cfu）时，必须能保证支持菌种生长。 适当的环境控制程序应当包括确认和评估取样点以及确认环境的微生物取样方法。 6 鉴别被分离菌株的方法应当用微生物指示剂(见 微生物限度检查（Microbial Limit Tests） 61)验证。 取样策略和位置的确立 在洁净室或其它控制环境启动或试车初始阶段，就应当确定空气和表面取样的特定位置。 应当考虑到与产品的接近度、空气和表面是否会与产品或者容器闭包系统的敏感表面有接触 的可能性。这样的区域应当作为关键区域，需要

19、进行比非产品接触区更多的监测。在安泰乐 装瓶操作中，典型的操作区域包括容器闭包配备、容器开启路径以及其它工作人员常规处理 的无机物体(如污染物)。 取样频率要依据特定位点的重要性和对于产品无菌操作后的后继处理来定。表 2 显示的为 与被取样的控制环境中区域重要性相关的降序排列的建议取样频率。 表 2. 基于控制环境重要性的建议取样频率 样地面积取样频率 洁净级 100 或更好的设计室每个操作交接 刚靠近洁净级 100 的支持区 (如 10,000 洁净级)每个操作交接 其它支持区(100,000 洁净级)每周两次 潜在的产品/容器接触区每周两次 其它无菌操作区但非产品接触区支持区(100,00

20、0 洁净级或较低) 每周一次 由于操作过程中手工介入的增加以及人员接触产品潜在性的增加，使得环境监测程序的相对 重要性增加。环境监测对于无菌操作生产的产品来说，远比生产后进行终端灭菌的产品要重 要得多。确定和定量对后继灭菌处理具有抗性的微生物，远比在制造环境周围进行微生物环 境监测要重要得多。如果终端灭菌循环不是基于过度杀伤循环，而是基于生物负担优先灭菌， 那么生物负担的评估就是关键性的。 取样策略应当是动态性的，即监测频率和取样策略位置的动态性。其动态调整是以趋势特征 为根据的。根据这一趋势可以进行适当的增加或减少取样。 建立控制系统的微生物警告和行动标准 统计过程控制的概念和原理，对于建立

21、警告和行动标准以及趋势应答是有用的。 微生物环境监测的警告标准，即微生物水平呈现源自标准操作条件的潜在变化。超过警告标 准并不一定需要最后的改善行动，但是它至少应该提示进行继而的书面调查，其内容包括取 样策略的修正。 微生物环境监测的行动标准，是微生物水平超过此标准时，如需要则应立即采取改善行动。 7 行动标准通常是根据特定控制环境常规运转期间所得历史信息来确定的。 对于新设备，这些标准通常是根据从相似设备和操作过程所得的先前经验来确定的，并且至 少应依据几个星期的微生物环境水平数据的评估来建立基线。 在确定频率的情况下，为了确保适当性，对这些标准通常要进行再考查。当历史数据表明条 件改善时，

22、对这些标准可以进行再考查并做能反映实际条件的改变。如果有趋势表明环境质 量恶化，则需要注意检测直接原因并建立改善行动计划以使条件回到原期望值范围。无论如 何，应实行调查，且对产品造成影响的潜在性因素做出评估。 控制环境微生物的考察及行动标准 洁净室及其它控制环境的分级依据联邦标准 209E，此标准是基于对这些环境总颗粒计数来 确定的。药用和医疗用具企业通常采用分级为 100 级、10,000 级和 100,000 级，特别的针 对设备的建设规范。 虽然在 209E 控制环境级别和微生物水平之间没有建立直接的联系，可制药工业采用与这些 级别相关的微生物标准已经有许多年了。并且这些标准当前已用于

23、GMP 认证的评估。2在控 制环境中应用当前的技术来达到这些标准是很容易的。 有相关报道显示，由于取样系统的不同、培养基的差异以及孵育温度的不同，可导致这些测 量值的不同。应当认识到，虽然没有绝对完美的检测系统，但它的存在确实能够帮助我们检 测环境质量的变化，进而了解其趋势。表 3, 4,和 5 中所示的值代表个别测验的结果，仅作 为指导性建议。每一厂家的数据必须作为整个监测程序的一部分来进行评估。 表 3. 以菌落形成单位（cfu）表示的控制环境中空气洁净指导方针 (用 Slit-to-Agar 取样器或同等物) 级别*每立方米空气的 cfu *每立方英尺空气的 cfu SIU.S. 习惯

24、M3.5100少于 3少于 0.1 M5.510,000少于 20少于 0.5 M6.5 100,000 少于 100少于 2.5 * 定义于联邦标准 209E, 1992 年 9 月. * 应该取足够体积的空气样品，以检测超特定限度的偏差。 表表 4. 以以 cfu 表示的控制环境中仪器和设备表面洁净指导方针表示的控制环境中仪器和设备表面洁净指导方针 级别每接触板的 cfu * 8 SIU.S. 习惯 M3.51003 (包括底面) M5.510,0005 10 (底面) * 接触板区域从 24 到 30 cm2不同。当取样过程用到冲洗时，区域面积应大于或等于 24 cm2 ，但是不能超过

25、30 cm2。 表 5. 以 cfu 表示的控制环境中工作人员活动表面洁净指导方针。 级别每接触板的 cfu* SI U.S. 习惯手套 工作人员衣着 & 装束 M3.510035 M5.510,0001020 * 见表 4 下注 (*)。 活性空气播散微生物定量的方法学和仪器操作 控制环境中空气播散微生物能够对这些区域内半成品或最终产品的微生物质量起到影响。这 一观点已被科学家们所普遍接受。另外人们也普遍接受这种观点，即空气播散微生物的估测 也会受到执行这些分析所用仪器和相关操作的影响。因此，当方法和仪器有所变化时，应当 确定其所获结果的一般等价转换。我们期待将来的技术进步可以带来革新，以提

26、供比现有可 用方法更高的精密度和敏感度，并且可用确定微生物数量检测中的变化绝对值。 目前，美国制药和医用器材工业最常用的取样器为嵌入式和离心取样器。以下所列取样器均 可通过商业购买得到，仅作为信息提供。对特定取样器的选择、购买和充分利用则由使用者 负责。 Slit-to-Agar空气取样器 (STA) 这一取样器是依据多种控制环境表 3 的微生物指导方针 的一种仪器。其动力来源为附属可控真空装置。空气通过一个标准化的缝隙进入缝隙下面设 置的缓慢回转式有盖培养皿，皿内含有营养琼脂。空气中的颗粒物质具有足够的质量撞击琼 脂表面，使得活菌能够在其表面生长。通常用吸入稀疏空气的方法来减小空气层流区域的

27、干 扰。 滤网取样器（Sieve Impactor） 此装置包括一个容器，可以调节含营养琼脂的有盖培养 皿。装置的盖子有穿孔，穿孔的大小是预先设计好的。真空泵通过盖子的穿孔抽取已知体积 的空气，空气中含有微生物的颗粒就与有盖培养皿内的琼脂培养基碰撞。一些取样器具有一 9 系列串联级有孔容器，其穿孔按大小降序排列。这些装置能够依照尺寸范围分级测量含活性 微生物的颗粒样品，因为颗粒是经过有大小尺寸的穿孔而到达琼脂平板表面的。 离心取样器（Centrifugal Sampler） 此装置包括一个推进器或涡轮，以推动已知体积的 空气进入装置内部，然后向外推进空气使其与独立设置在一个柔韧塑料基板上的营养

28、琼脂条 碰撞。 无菌微生物房（Sterilizable Microbiological Atrium） 此装置是单孔滤网打入器的一种变 型。装置的盖子含有均匀分布的约 0.25 英寸的小口。装置的基底适合于一个含营养琼脂的 有盖培养皿。由真空泵来控制通过装置的空气运动，并可以应用多重装置控制中心和远距离 取样探针。 表面空气系统取样器（Surface Air System Sampler） 这是一种整合装置，包括一个适合 琼脂接触板的进入部分。紧接着接触板的后面，是一个传动器和涡轮，可以推动空气穿过装 置中琼脂接触板的有孔盖子，以及穿过传动器远端。也可以有多重包埋组合。 凝胶薄膜过滤取样器（G

29、elatin Filter Sampler） 这一装置包括一个带有延长管的真空泵， 延长管的终端是一个滤纸夹，此末端可以被放置于遥远的关键性空间。滤纸含有无规则明胶 纤维，对空气播散微生物起到防卫作用。经过特定的暴露时间后，滤纸被无菌的移开，并用 适当的稀释剂溶解，然后涂于适当的琼脂培养基上进行微生物含量的评价。 沉降皿（Settling Plates） 作为一种简单和廉价的方法，仍被广泛用于延长暴露时间的环 境品质评估。但是开放性琼脂填充培养皿或沉降皿的方法，不能用于对关键环境进行微生物 污染的品质评估。 机械空气取样器的一个主要的缺陷是对被取样空气样本量的限制。如果一个控制环境的空气 微生

30、物水平期望值为不高于 3 cfu 每立方米，那么就需要对几个立方米的空气进行测试，进 而得到准确度和精确度合乎给定标准的结果。通常这是不切实际的。为了显示环境中存在的 微生物数量不随时间而增加，可能就需要通过延长取样时间来确定取样时间是否是一个限制 性因素。具代表性的有，slit-to-agar 取样器具有每分钟 80 升的取样能力(对于表面空气系统， 此能力有时可能会更高)。如果检测 1 立方米的空气，接着将需要暴露时间为 15 分钟。用这 过多的 15 分钟取样时间，对于获得代表性的环境样品，可能是必需的。尽管报导有一些取 样器，其取样体积比率能达到很高，可是这些情形中存在的对任何关键区域

31、气流模式的潜在 破坏性或是能够增加污染可能性的紊流形成，都应该给予考虑。 对于离心空气取样器，许多前期的研究表明，所取样品显示了对较大颗粒的选择性。这种类 型取样器的应用，可能会由于其固有的选择性，引起比其它类型空气取样器更高的空气播散 计数。 10 当选择离心取样器时，应当考虑到取样器对取样位置的控制区域气流线性的影响。如果忽略 所用取样器的类型，则远距离探针的应用需要检测其额外的配管对活性空气播散计数没有不 良影响。 如有影响，则应设法消除；如果无法消除，则应当在报告结果时引进校正系数。 测量控制环境内活性微生物污染表面取样的仪器和方法学 微生物环境控制程序的另一组成部分是这些环境中仪器、

32、设备以及工作人员着装的表面取样。 在制药工业中，表面取样方法和程序的标准化程度还不及空气取样程序的标准化程度广泛。 3 为使对关键性操作的影响最小化，表面取样应该在该操作的结尾进行。表面取样可以通过 应用接触平板或者水刷方法来完成。表面监测通常在于产品有关联的区域或与这些区域相邻 近的区域表面进行。装有营养琼脂的接触平板通常应用于规则的或平坦的表面取样，并且在 给定温度下直接孵育适当时间以对活菌进行定量检测。对于真菌、孢子等的特殊定量检测应 当用专门的琼脂。 水刷方法可以用于不规则表面的取样，尤其是仪器表面。在规则表面，水刷法可作为接触平 板方法的补充。取样后，将水刷置于适当的稀释剂冲之中，然

33、后在适当的营养琼脂上或其中 接种适当量以进行微生物计数评估。将要被刷的区域用适当大小的无菌模板确定。通常其大 小在 24 到 30 cm2范围内。对报告的每接触板或每刷进行微生物学评估。 微生物取样或定量用培养基及稀释剂 控制环境中用于微生物取样或定量的培养基类型是液体还是固体，取决于所用仪器和操作的 过程。当需要固体培养基时，一般选用通用的大豆-酪蛋白消化琼脂培养基。其它固体和液 体培养基见下表。 液体培养基液体培养基*固体培养基固体培养基* 胰蛋白胨盐大豆-酪蛋白消化琼脂 胨水营养琼脂 缓冲盐水胰蛋白胨葡萄糖浸液琼脂 缓冲明胶卵磷脂琼脂 浓缩缓冲明胶脑心浸液琼脂 脑心浸液琼脂平板 大豆-酪

34、蛋白培养基 * 液体和固体培养基已用有效方法进行过灭菌处理. 这些培养基的脱水型都可以在市场上购买到。它们的即用型也能够买得到。当控制区域用了 消毒剂或抗生素时，应当考虑应用具有适当灭活剂的培养基。 11 可以从上表中选择培养基，如果确证其能够有效到达预期目的。 来自环境控制程序的微生物隔离群的鉴别 环境控制程序包括对从样品中获得的菌丛进行适当标准的鉴别。具有控制环境中一般菌株的 知识，能帮助我们预先确定被监测设备通常的微生物菌株；评估洁净和清洁卫生处理程序、 方法及试剂的有效性；并恢复一些方法。通过鉴别程序收集的信息，在对污染源的调查中也 是有用的，尤其是当其超过行动标准时。 鉴别从关键区域

35、以及紧邻关键区域得到的隔离群，应当优先于对非关键区域微生物的鉴别。 鉴别方法应当校验，而且即用试剂盒的质量与其预期目的相当。(见环境控制程序设计和实 施中的相关关键因素)。 洁净室和其他控制环境中无菌填充产品微生物状况的操作评估 控制环境的监测是通过适当的环境监测程序进行的。为了确保得到最小生物负载，控制环境 中微生物状况评估的额外信息，可以通过应用培养基填充来获得。一个可接受的培养基填充 可以在生产线上对点及时成功模拟出产品的流程。然而，其它的因素也是重要的，比如适当 的设备构建、环境监测以及人员培训。 当一套无菌操作系统被制定和安装时，通过至少连续三次成功的培养基填充以检测微生物状 况的合

36、格性通常是必需的。培养基填充是用生长培养基替代原产品，以检测微生物的生长。 在培养基填充程序的发展过程中值得注意的问题如下：培养基填充过程、培养基的选择、填 充体积、孵育时间和温度、填充装置的检查、文件证明、结果解释以及需要的可能改善行动。 由于设计培养基填充是为了模拟特定产品的无菌过程，使得培养基填充过程中，正常产品生 产流程条件对其的影响显得重要了。这包括整个的工作人员、所有的加工处理步骤以及构成 一般产品流程的原料。培养基填充生产期间，应当计划发生在实际产品生产流程期间的多种 初始文件性干涉(如改变填充针、固定组件塞)。 为了增加安全域，可以选择性的进行可能条件的联合应用。实例可能包括频

37、繁启动和停止顺 序、非预期的处理系统修复、滤纸的替换等等。取得无菌操作资格不需要每一产品的检测， 而应当对每一生产线进行检测。容器的几何形状(容器的大小和其开启)和流水线的速度都是 无菌操作线上的可变因素，因此应当在生产线质控上对这些因素进行适当的结合，最好是在 终端结合。产品应用的原则应当形成文件性指导。 12 1987 年 FDA 关于通过无菌操作生产无菌药物制剂的指导方针指出，培养基填充流程应覆 盖对于生产线/产品/容器结合的所有生产换岗。这一指导方针应不仅仅被认为是培养基填充 流程的质控，而且应看成是周期性再评估或再生效的指导。培养基填充程序还应当模拟扩展 运行的生产实践。这可以通过在

38、产品生产运作末端进行培养基填充运作来实现。 通常，像大豆酪蛋白牛肉汤这种已经用一系列水平低于 100 cfu/unit 的指示微生物 (见 无菌 检查（Sterility Tests）71)进行过促生长检验的通用丰富培养基，可以被应用。来自将要进 行无菌操作生产的控制环境中的隔离群也可以被应用。培养基的无菌操作之后，填充容器被 置于 22.5 2.5 或 32.5 2.5 进行孵育。所以填充培养基的容器至少应当孵育 14 天。如果 培养基样品的孵育温度有两个，那么这些填充容器在每个温度下至少要孵育 7 天。孵育过后， 应当对培养基填充容器进行生长检查。培养基填充隔离群以属进行鉴别，如果出于调查

39、污染 源为目的的需要，可能的话要鉴别到种。 在进行培养基填充时关键性问题有：使无菌操作质量合格的填充数量，每一培养基填充的单 位数量，对结果的解释以及改善行动的实行。据以往经验，常在质控初始或设备初启时采取 3 个培养基填充运行来证明无菌操作线程的连贯性。0.1%污染率是一个成功培养基填充运行 的可接受标准，用于证明污染率不超过 0.1%的最小单位数至少应为 3,000。应当强调指出， 美国以及其它国家的的许多生产商在单次培养基填充运行时填充单位超过了 3,000。4 中试 工厂用于制备临床批产品的设备，可以用较小的培养基填充。 许多国际性文件(即 ISO 和 EU-GMP)也已经引用了 3,

40、000 培养基填充单位中期望零阳性检 出在 95%置信度。可是，公认的为了确证过程中实测污染率的统计真实性，就需要进行重 复的培养基填充运行。 PDA 技术专题论文 17 期 4的“当前无菌制造业实践的调查”表明，许多生产商认为他们的 无菌操作过程能够使污染率低于 0.1% 既然洁净室最关键的污染源是工作人员，那么在培养基填充过程中能够对相关生产活动中污 染事件起到帮助的可视性文件就应得到支持。无菌测试隔离系统的广泛应用，已经表明无菌 操作中去除人员确实能减少污染的发生。 目前出现的先进无菌操作技术综述 由于无菌操作中人员的参与和介入与产品污染潜在性之间存在密切的联系，所以设计并运行 了可以使

41、人员和关键区域相隔绝的生产系统。研究减少污染可能性的方法包括自动化装备、 阻挡层以及隔离系统。采用这些先进无菌操作策略的设备现已投入运行。在应用这些设备的 13 地方，人员已经被完全排除在关键区域之外，那么基于颗粒和环境微生物监测需求的洁净室 分类的必需性可能就会明显的减少了。 以下是关于一些目前应用于无菌操作用以减少污染的系统的定义： 阻挡层（Barriers） 在无菌操作系统里，阻挡层是一种装置，用来限制操作人员与阻挡层 内被隔离无菌区域之间的接触。这些系统用于无菌填充，同时也用于医院药房、实验室以及 照管动物设备。阻挡层可以是没有灭过菌的，并且不能总是有准许没有暴露在周围环境中的 原料进

42、出/出通行的传递系统。阻挡层可以是围住关键生产区域的塑料屏障，也可以是在现 代无菌填充设备外建立的坚硬的外壳。阻挡层也可以结合一些元素，如手套孔、不完全工作 服以及快速传递通道等。 Blow/Fill/Seal 这种类型的系统将容器吹成型、产品填充以及单片设备加封操作相结合。 从微生物学角度来看，使容器成型、装入无菌产品以及封盖的形成和应用这系列连续事件， 达到了连续的无菌操作并使其于环境中的暴露最小化。这些系统的存在已有大约 30 年的历 史，并且显示出使污染率到达低于 0.1%的能力。当综合和分析组和培养基填充数据时， blow/fill/seal 系统的污染率能够达到 0.001%。 隔

43、离器（Isolator） 这一技术可有双重目的应用。一个是保护产品免受来自环境中的污染， 包括装入和封闭过程中的人员方面污染；另一个是保护人员免受正在制造的有毒或有害产品 的影响。 隔离器技术基于在无菌环境中预先放置已灭菌组件（容器/产品/闭包）原则。这些组件在整 个操作过程中保持无菌状态，是因为没有任何人员或是非灭菌组件被带进隔离器。隔离器屏 蔽是一个完全的屏蔽，它不允许保护环境与非保护环境中物质的互换。隔离器或者是物理水 平的封闭外界环境污染的进入，或者可能是通过应用连续的超压起到有效的封闭作用。人员 对原料的处理是通过手套、半身或全身工作服进行的。所有进入隔离器的空气都要通过 HEPA

44、或 UPLA 过滤器，典型的废气通过 HEPA-级滤器排出。过氧乙酸和过氧化氢蒸汽通 常用于隔离器单位内部环境表面的灭菌。隔离器本身内部以及所有其内容物的无菌水平通常 可以保证到达 106。 设备、组件以及原料通过许多不同操作步骤被引入隔离器：运用双通道高压灭菌器；通过无 菌通道用输送带连续引入组件；传送容器系统通过对接系统在隔离器外壳中的运用。对隔离 器组件的完整性、校准以及保养的紧密监测也是必需的。 控制环境中围绕这些针对无菌操作的较新技术所需条件，应当依应用技术的类型而定。 限制了工作人员与产品的接触的 Blow/Fill/Seal 设备可能会放置在控制环境中，尤其是生产 过程中工作人员

45、可能以某种形式介入的区域。 14 阻挡层系统可能会对控制环境有些形式上的需要。由于阻挡层系统类型和用途的多样性，这 就造成了阻挡层系统所需周围环境的多样性。因此制造商不得不将围绕这些系统的环境的设 计和工作策略进行发展，以使其成为合理的有利的模式。如果不管这些策略，那么系统制造 无菌产品的能力必须被验证有效，且与此前建立的标准相一致。 对于隔离器，空气通过整个 HEPA 级或更高质量的过滤器进入其中，且其内部经过典型的 灭菌处理，其无菌程度保证在 106水平。这样，隔离器就包含有无菌的空气，不与周围环境 进行空气交换，且是隔离于操作人员的。有建议表明，当一个控制环境中存在隔离器时，手 套和制服

46、上的小孔渗漏事件对产品造成污染的潜在性是减少了。 这些先进系统对无菌操作的环境微生物监测的程度和广度，依赖于其应用的系统类型。制造 商应当用通过监测结果而获得的利益来平衡需要人员介入的环境取样系统的频率。由于阻挡 层系统的设计是为了把人员的介入减到最小，那么就应当用远距离取样系统来替代人员的介 入。总的来说，一旦确立了阻挡层系统的有效性，用以监测无菌操作区域微生物状况的取样 频率与传统的无菌操作系统的取样频率相比较，应当被减少。 隔离器系统的微生物监测频率相对较少。连续的总粒子监测就能够为隔离器内的空气过滤系 统处于正常工作状态提供可靠保证。本章所述对微生物质量进行控制的方法，对于隔离器内 部

47、的环境测试来说，其敏感度可能不足。对隔离器的经验提示，在正常操作的情况下，手套 上的漏洞或小孔是微生物污染潜在性的主要代表；因此，经常性的检测手套的完整性以及对 其进行表面的监测是必需的。隔离器内的表面监测对于珍贵的主药也是有益的。 词汇表词汇表 空气播散颗粒计数（空气播散颗粒计数（Airborne Particulate Count）(也指总颗粒计数)检测 0.5 m 以及 更大的微粒。当详细说明许多颗粒的时候，其指的是每立方米空气（或每立方英尺空气）中 最大允许颗粒数 。 空气播散活性颗粒计数（空气播散活性颗粒计数（Airborne Viable Particulate Count）(也指

48、总的空气散播需氧微 生物计数)当详细说明许多微生物的时候，其指的是每立方米空气（或每立方英尺空气） 中菌落形成单位(cfu)最大数值，此值与基于空气散播颗粒计数的控制环境的洁净级相关。 无菌操作（无菌操作（Aseptic Processing）一种加工处理药学和医学产品的模式，包括产品的单 独灭菌、产品包装（容器/闭包或医疗器械的包装）、产品装入容器的传递以及其闭包，均 在微生物临界控制条件下进行。 空气取样器（空气取样器（Air Sampler）用来采集在特定时间的测量空气样品，从而测量控制环境中 空气颗粒或微生物情况的设备或装置。 15 换气（换气（Air Changes）控制环境中的空气

49、每单位时间（分、小时等）被更换的频率。空气 可以局部循环或整体更换。 行动标准（行动标准（Action Levels）控制环境中的微生物学标准，特指在标准操作过程，当超过 此标准时，应当启动调查并基于此调查进行改善。 警告标准（警告标准（Alert Levels）微生物的水平，特指在标准操作过程，当超过此标准时，应当 调查以确定进程是否仍然处于控制范围内。警告标准对于给定的设备是特定的，且是以环境 的检测程序下制定的基线为根据建立的。这些警告标准可依赖检测程序中的趋势分析而修改。 警告标准总是低于行动标准。 生物负担（生物负担（Bioburden）在项目中检测到的微生物总数量。以某条款为指导进

50、行检测。 洁净室（洁净室（Clean Room）一房间，其空气播散颗粒浓度被控制达到特定的空气播散颗粒洁 净级别。并且环境中的微生物浓度是被监测的，定义每一洁净级别也分配于空气、表面和全 体传动装置的微生物水平。 洁净区（洁净区（Clean Zone）定义一个空间，控制其中的空气散播颗粒浓度和微生物浓度，使 其能达到特定洁净级别。 控制环境（控制环境（Controlled Environment）一个无菌处理系统中的任何区域，其空气散播颗 粒和微生物被控制在特定水平，以在此环境进行适当的操作。 控制环境试车（控制环境试车（Commissioning of a Controlled Enviro

51、nment）通过工程和质量控制 证明，环境是依照期望洁净级别的规范建立的，且在正常操作条件（或最坏情况条件）中可 能遇到的情况下，其有能力进行无菌处理。试车包括培养基填充运转和环境监测程序结果。 改善行动（改善行动（Corrective Action）在标准化操作规程中需执行的行动，当某一条件超标时 即启动。 环境隔离群（环境隔离群（Environmental Isolates）从环境监测程序隔离出的微生物。 环境检测程序（环境检测程序（Environmental Monitoring Program）文件性程序，通过标准化操作规 成实现，其详细描述了在控制环境中（空气、表面和全体传动装置）用

52、于监测颗粒和微生物 的程序和方法。此程序包括取样点、取样频率以及如果超过警告或活动标准后应采取的跟随 调查和改善行动。同时也描述了用于趋势分析的方法学。 设备布局（设备布局（Equipment Layout）无菌处理系统的图解表示法，用来表示设备和人员之间 的关系。此布局被用于危险率估计，并根据产品/容器/闭包系统微生物污染的潜在性，确定 取样点和取样频率。改变必须经由责任管理人员的评估，因为未经认可的改变设备或人员的 布局可能导致产品/容器/闭包系统污染潜在性的增加。 16 联邦标准联邦标准 209E（Federal Standard 209E）“洁净室和洁净区内空气播散颗粒洁净级别” ，是

53、被 the Commissioner, Federal Supply Services, General Service Administration 核准 的用于“所有联邦机构”的一项标准。此标准依据特定空气播散颗粒浓度，建立了空气洁净 级别。这些空气洁净级别通常被发展为电子行业 “超净” 控制环境。在制药行业中，联邦 标准 209E 被用于特指控制环境的建造。无菌处理系统通常呈现为 100 级、10,000 级和 100,000 级。如果此分级系统应用于颗粒等于或大于 0.5 m 的基础上，那么这些级别就分 别以 M3.5、M5.5 和 M6.5，呈现为 SI 系统。 过滤完整性（过滤完整性（Filter Integrity）确定过滤功能型操作是令人满意的 如：邻苯二甲酸二辛 酯(DOP)和始沸点测试 测试。 原料流动（原料流动（Material Flow）原料和人员进入控制环境的流动应该遵循特定的和文件性的 途径，其途径的选择是用以减少或最小化产品/闭包/容器系统微生物污染潜在性。偏离规定 流程可能会导致微生物污染的潜在性增加。原料/人员流动可以改变，但是其改变的结果从 微生物学角度看应该由责任的管理人员评估，且必须经认可和证明。 培养基生长促进（培养基生长促进（Media Growth Promotion）此操作参考无菌检查（Sterility