分光光度计测还原糖含量-中国农大生化实验实验报告

1、.实验报告实验名称： 班级：实验人： 实验时间：研究背景与目的：掌握还原糖含量测定的方法之一的3,5-二硝基水杨酸比色法，熟悉722分光光度计的主要用途、工作原理及使用流程。实验原理：已知在植物体内含有一定量的还原糖，利用还原糖的还原性，使其与3,5-二硝基水杨酸反应，生成有吸光性的3-氨基-5硝基水杨酸。在某浓度范围内，该物质在540nm下的光吸收与还原糖含量成正比，通过测定该物质的消光值，查对标准曲线，便可得样品中还原糖含量。仪器与试剂：722光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司） 电热恒温水浴锅（型号：双列八孔 标号：09035 天津市中环实验电炉有限公司） 电磁炉 架盘天平 具塞刻

2、度试管 15ml*9 移液器 100ul1000ul 容量瓶 100ml*9 烧杯 研钵 漏斗2mg/ml 葡萄糖标准液 10mg/ml 3,5-二硝基水杨酸溶液蒸馏水实验步骤：1标准曲线的制作取7只15ml具塞刻度试管，编号，分别加入葡萄糖标准液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，然后用移液器向各试管加蒸馏水，使最后体积为1.0毫升，摇匀，再各加入3,5-二硝基水杨酸溶液1毫升，摇匀，在沸水浴中准确加热5分钟，取出冷却至室温，用蒸馏水稀释至15毫升混匀，用分光光度计在540nm下测定消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。2植物样品中还原糖的提取将植物

3、样品苹果称取1g放入研钵中，加入少量石英砂，磨成匀浆，转移到100毫升容量瓶中，用蒸馏水少量多次地清洗研钵，再将洗液转移到容量瓶中，至70-80ml，摇匀，置于80度恒温水浴中浸提半小时，其间摇匀数次，是还原糖浸出。3还原糖含量的测定待上述提取液冷却到室温，过滤，滤液达十几毫升即可，取滤液1毫升放入15ml具塞刻度试管中，加入1毫升3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在沸水浴中准确加热5分钟，取出冷却后稀释到15毫升。使用722分光光度计测定OD540值。（作两个重复组取平均值）。数据整理与计算：编号123456789浓度mg/ml0.0000 0.01330.04000.06670.09330.

4、12000.13330.05310.0525吸光度0.000 0.0630.2540.4560.6580.8390.9410.3540.350 从标准曲线中查出样品的OD540值对应的还原糖量A（mg/ml），然后按下列公式计算样品中还原糖含量。 还原糖含量（%）=【A*样品稀释总体积（ml）/（样品重*1000）】*100%将数据代入公式，得（1） 还原糖含量=【0.0531*15*100/(1*1000)】*100%=7.96%（2） 还原糖含量=【0.0525*15*100/(1*1000）】*100%=7.88%（3） 平均值=（7.96%+7.88%）=7.92%结果分析：所得两组数

5、据的吸光度值不相同，以至于所得浓度也不相同，其中可能存在的原因是使用具塞刻度试管稀释时存在终点标定误差。然而两组数据取平均值，使误差减小在允许范围内。思考题：1 比色测定法的原理及特点是什么？原理：光吸收定律即朗伯-比尔定律，由于物质对光有选择吸收的作用且在一定浓度范围内，物质在某波长下的光吸收与其浓度成正比，所以利用标准溶液求得标准光吸收曲线，再根据所得吸光度值在标准曲线中寻找相对应的点即可知道未知溶液的浓度。光吸收简便，快速，灵敏度高，准确度较高，应用广泛。2 比色测定法中为什么要设空白，设空白时要注意什么？消除溶液中其他因素的影响，设置空白时要注意只有葡萄糖浓度一个自变量变化，保证其他量

6、均相同。3 试分析一下样品的稀释倍数是如何确定的以及对测定结果的影响。实验原理中讲到，在一定浓度范围内，吸光度与还原糖含量呈正比，由由于吸光度要控制在0.2至0.8之间，所以所需浓度便可知，即可通过稀释溶液实现。如果不在范围内，则超出呈正比的范围，所得浓度就会不准确。4 为什么还原糖与3,5-二硝基水杨酸溶液要先反应后稀释？因为稀释前还原糖浓度较高，并且3,5-二硝基水杨酸溶液过量，这样可以使得还原糖充分反应，如果先稀释则还原糖浓度较低，反应时间加长，速率较慢。5 结合实际应用，你认为本实验设计有什么不合理之处？实验中，容量瓶的使用。参考文献：揭念芹基础化学2000年9月第一版 2008年7月第八次印刷 孙英分析化学实验2009年3月第一版袁静明 赵强 3,5二硝基水杨酸法测定葡萄糖方法的改进（山西大学学报（自然科学版）1986年01期 722分光光度计的使用说明/view/92586d37ee06eff9aef8079b.html实验小结：这是第一次的生物化学实验，与同伴的配合中仍然存在着默契程度不足的问题，相信在日后的实验中会有所改进，其次，由于在实验前