生物化学与分子生物学：基因表达调控-转录调控1

1、基因表达的调控 转录调控部分,第十章、基因表达的调控转录调控 一、基因表达调控的概述 二、mRNA的生物合成（转录） 三、原核生物基因转录的调控 四、真核生物基因转录的调控 五、原核与真核生物基因表达调控研究方法学 六、表观遗传,The central dogma of genetics (中心法则,DNA有序地将遗传信息，通过转录和翻译的过程转变成蛋白质，执行各种生理生化功能，完成生命的全过程。从DNA到蛋白质的过程，叫做基因表达(gene expression)，对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control,一）基因表达的时间性及空间性,1）

2、时间特异性,2）空间特异性,基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity,在个体生长的过程中，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity,TSE基因在不同器官的表达,二）基因表达的方式,1）组成性表达（constitutive gene expression) 管家基因（housekeeping gene） e.g.-actin, GAPDH, -Tubulin,按对环境刺激的反应性，基因表达的方式可分为,无

3、论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为组成性基因表达(constitutive gene expression,1）组成性表达,二）基因表达的方式,1）组成性表达（constitutive gene expression) 管家基因（housekeeping gene） e.g.-actin, GAPDH, -Tubulin,按对环境刺激的反应性，基因表达的方式可分为,2）协调表达(coordinate expression) 可分为：诱导（induction）大多数原核生物的mRNA是

4、从几个首尾相连的结构基因一次转录而成，称为多顺反子mRNA（polycistronic mRNA,转录模板DNA because it can induce the transcription from the lac operon even with unusable carbon source, it is sometimes called consoling inducer (安慰诱导物,诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要转运酶，转运酶的合成需要诱导,存在矛盾,如何解释,Leaky gene expression: the repressor sometimes fa

5、lls off DNA w/o inducer,operon,1. RNA polymerase; 2. repressor; 3. promoter,4. operator; 5. inducer; 6-8. structural genes,Transcription on,Transcription off,四）乳糖操纵子CAP的正调控,cAMP-CAP复合物与DNA结合，改变DNA结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链，从而促进RNA聚合酶和启动子结合，使转录能力增强,cAMP-CAP复合物的形成取决于AMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于葡萄糖代谢产物抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能

6、转化为cAMP， cAMP浓度下降，不能形成cAMP-CAP复合物，乳糖结构基因不能被转录,当大肠杆菌生长的培养基中既有葡萄糖又有乳糖的条件，只利用葡萄糖，而不利用乳糖、阿拉伯糖等其他糖，不产生代谢这些糖的酶，直到葡萄糖消耗完毕，其他代谢的酶才会根据相应的糖是否存在而被诱导产生，这种现象称为“葡萄糖效应,乳糖操纵子的协调调控,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性,总结：四种条件下的乳糖操纵子,Operon off, CAP not bound,Operon off, Lac repressor bound CAP

7、not bound,Operon off Lac repreeor bound,Operon on,四、色氨酸操纵子（Trp Operon)调控系统,阻遏体系（a repressible system,一）色氨酸的生物合成,色氨酸的合成主要分6步完成，有7个基因参与整个合成过程。trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基,tryptophan Bio-synthesis from precursor chemicals,分支酸,邻氨基苯甲酸,磷酸核糖基邻氨基苯甲

8、酸,吲哚,L-色氨酸,吲哚甘油磷酸,CDRP,二）色氨酸操纵子的结构功能,结构基因：trpE, trpD, trpC, trpB, trpA,二）色氨酸操纵子的结构功能,调控区：trpP, trpO, trpL,Trp 缺乏，Trp 操纵子被打开，5个结构基因表达，产生酶，催化分支酸合成为Trp,当有足够的Trp时，操纵子自动关闭，细菌直接利用外界的Trp,三）色氨酸操纵子的调控机制,色氨酸操纵子受到双重负调节作用： （1）阻遏蛋白的阻遏作用： 无Trp时，阻遏蛋白不能与操纵元件结合，对转录无抑制作用。 足够Trp时，阻遏蛋白与色氨酸形成复合物后与操纵元件结合，抑制转录。 （2）弱化作用： 调

9、节作用比操纵元件更灵敏。 什么是弱化作用,调节区与结构区域之间有一个前导序列,弱化子（attenuator）：位于操纵子中第一个结构基因之前，是一段能减弱转录作用的序列,色氨酸的弱化子位于L基因中，位于第一个结构基因E上游约3060个核苷酸。 L基因转录产物是一段长约140个核苷酸的前导mRNA,mRNA前导区的结构特点,trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的特殊序列，能以不同的方式进行碱基配对，片段1和2、2和3、3和4能配对形成发夹结构。 形成发夹结构能力强弱： 序列1/2序列2/3序列3/4,4,a,b,1）具有4段能够形成发夹结构的特殊序列,

10、片段3和4 所形成的发夹结构之后紧接着寡尿嘧啶，是不依赖于r因子的转录终止信号,2） 转录终止信号,转录的弱化理论认为mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感,3） 前导mRNA的第一片段含有两个相邻的色氨酸,原核生物的转录和翻译是偶联的,5,3,DNA,核糖体,RNA,RNA聚合酶,当培养基中色氨酸的浓度很低时，这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录,转录弱化作用,5,3,DNA,核糖体,RNA,RNA聚合酶,2

11、,3,1,低浓度的Trp情况下,4,当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构,转录停止，trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。所以，弱化子对转录的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置,5,3,DNA,核糖体,RNA,RNA聚合酶,2,3,4,在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不配对，3-4区可以配对形成终止子结构，转录停止,高浓度的Trp情况下,1,An inducer (tryptophan) activates both the repre

12、ssor and attenuator (coupled with translation,Trp浓度高时，阻遏自身合成Trp,优先利用环境中的Trp,分支酸,L-色氨酸,Trp浓度低时，转录出分解分支酸所需的酶，自身合成Trp,AraC 蛋白可以同时结合于araI和araO2，将两个位点拉在一起，使DNA形成一个环，构成一种阻遏型构象。基因处于关闭状态,五、阿拉伯糖操纵子的调控系统,第十章、基因表达的调控转录调控 一、基因表达调控的概述 二、mRNA的生物合成（转录） 三、原核生物基因转录的调控 四、真核生物基因转录的调控 五、原核与真核生物基因表达调控研究方法学 六、表观遗传 七、哺乳动物

13、几个特定基因表达调控的例子及特异性基因表达与动物发育关系简论,一）真核基因组结构特点,一、真核生物基因表达总述,1）真核生物基因组结构庞大,2）单顺反子,单顺反子(monocistron) 即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链,3）基因不连续性 （4）重复序列,二）真核生物和原核生物转录的不同点,1）转录在细胞核内进行，蛋白质的合成则是在细胞质内进行,2）真核生物基因以单顺反子进行转录，原核生物基因多数以多顺反子进行转录 （3）原核生物只有一种RNA聚合酶，而真核生物有三种聚合酶； （4）真核生物RNA聚合酶不能独立转录RNA 。原核生物中RNA聚合酶可以直接起始转录合

14、成RNA ，真核生物则不能,二、真核生物的RNA聚合酶,真核生物有三种RNA聚合酶： RNA 聚合酶 I: 转录rRNA 和多数的snRNA RNA 聚合酶II: 转录所有的结构基因，产生mRNA前体 RNA 聚合酶 III: 转录 tRNA 及 5S rRNA,真核生物RNA聚合酶的组成 1.三种聚合酶都由2个大亚基和十几个小亚基组成 2.都具有原核RNA聚合酶核心a2bb同源的亚基； 3.RNA聚合酶II的最大亚基RBP1与b具有高度同源性，次大亚基与b相似。 4.除核心亚基外，3种RNA聚合酶都有共同的5个小亚基，各自还有5-7个特有的小亚基,真核生物RNA聚合酶II的特点,1.真核生物

15、RNA聚合酶II没有直接识别、结合DNA的能力，或能力很弱，不能独自启动编码蛋白质基因的转录 需要其他起始蛋白的存在，聚合酶才能与启动子结合并诱导起始,真核生物RNA聚合酶II的特点,2.RNA聚合酶II最大亚基的羧基末端有一段有共有序列（consensus sequence）为Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7的重复序列构成的片段，称为羧基末端结构域(carboxyl- terminal domain, CTD). 所有真核生物的RNA聚合酶II都具有CTD， 只是7个氨基酸共有序列重复程序不同,GENES result：basal level transc

16、ription (measurable but low,Activators,Activators bind to upstream activating sequences (UAS) to activate transcription,真核生物的基本转录因子,蛋白因子,功能,TBP,特异识别TATA盒,TFIIA,稳定TFIIB与TBP对启动子的结合,TFIIB,结合TBP，并结合聚合酶II-TFIIF复合体,TFIIE,结合RFIIH，具有ATP酶和解旋酶活性,TFIIF,紧密与聚合酶II结合；也与TFIIB结合； 阻遏聚合酶II和非特异的DNA序列结合,TFIIH,有解旋酶活性，是DN

17、A解开双链；使聚合酶II的 CTD磷酸化；结合核苷酸-切除修复蛋白,General transcription factor TFIID is a protein complex containing TBP (TATA Binding Protein) and a number of TAFs (TBP-Associated Factors,The saddle (马鞍) structure of TBP (TATA binding protein) with DNA,TBP (TATA-Binding Protein) makes minor groove contacts, bends

18、and distorts DNA,Basal Transcription Machinery,Should be TBP,真核RNA聚合酶II在转录因子帮助下，形成转录起始复合物,RNA聚合酶催化基因转录的过程可以分为4个期：装配期、起始期、延长期和终止期,真核生物基因转录的过程,转录的装配期,形成闭合复合体,TFIID,TFIIB,RNA pol II/ TFIIF,TFIIE,TFIIH,Low but measurable level transcription = basal transcription,转录的起始期,闭合复合体,可转录复合体,TFIIH,转录的延长期,延长期中，TFI

19、IF始终与RNA聚合酶II相连。 延长因子（elongation factors）增强了RNA聚合酶II的活性,转录终止期,RNA聚合酶II去磷酸化，进入再循环，启动另一次转录,酵母细胞的转录终止模式,Nature 432, 456-457(25 November 2004,真核生物RNA Pol II转录需要： 1.基本转录因子（general transcription factor or basal transcription factor） 2.特异转录因子（special transcription factor,基本转录因子为RNA聚合酶II结合启动子所必须，为真核基因mRNA转录

20、所通用。 特异转录因子则是通过结合相应的上游启动子元件激活某种特异基因的转录,A typical eukaryotic gene,Many transcription factors,Core promoter 核心启动子,or upstream activating sequence (UAS,转录起始,转录因子的特点,转录因子通常含有：DNA结合域（ DNA binding domain，DBD） 转录激活域（activation domain， AD） 介导蛋白质-蛋白质相互作用的结构域,转录因子含有不同的DNA结合域,1.螺旋-转角-螺旋 （helix-turn-helix,HTH,H

21、TH是由3个a-螺旋由b-转角连接而成,C-末端的a-螺旋是识别螺旋，与DNA大沟（major groove ）相匹配,结构与HTH结构域类似，是一种编码由60个氨基酸组成的结构域序列。由于最早在果蝇的同源框基因座（其基因决定身体结构的特点）中发现而得名,同源（异型）框存在于许多真核生物的DNA结合蛋白中，负责与DNA结合，与发育调控有关。在一些动物的转录因子中也发现了与同源框类似的短序列,2.同源异型框(homeobox,锌指是由保守氨基酸的小集团与锌离子结合形成类似手指状的DNA结合结构域。 锌离子稳定结构域中的a-螺旋结构，使其镶嵌于DNA的大沟里。通用转录因子TFIIA是典型的锌指蛋白

22、,3.锌指结构（zinc finger,亮氨酸拉链是由两条平行的a-螺旋（单体）通过规则位点上的亮氨酸残基相互作用所形成的对称二聚体结构。 单体的N端有一段富含碱性氨基酸的亲水区，是DNA结合域,亮氨酸拉链形成的二聚体构成茎，分叉对称的两个碱性区形成臂，与DNA结合,4.亮氨酸拉链结构（Leucine Zipper,5.碱性螺旋-环-螺旋结构 （Basic Helix-Loop-Helix，bHLH,N端有碱性氨基酸形成亲水区，与DNA结合，即DNA结合域,每一个bHLH单体有3部分构成： 两个a-螺旋，中间由一个非螺旋的环链接,增强子远离转录起始点，通常在1-4kb，有的甚至多达30kb，增

23、强子是如何远距离找到作用位点来调控基因转录,Visual evidence of looping model,300bp,启动子,1860bp,增强子,800bp,Sp1,E2,Basal Transcription machinery,Activities that Facilitate the Functional Interactions Between Activators and the Basal Transcription Machinery,Adapter/Cofactor/Coactivator/ Mediator/Bridging Factor,UAS,TATA,Initi

24、ator,GTFs,TFII-A, B, D, E, F, H & RNA Pol II,Activators,An (eukaryotic gene) enhancersome,DNA looping allows long-distance interaction,Should be TBP,Looping allows an activator to work from afar,需要掌握的知识点 一，定义： 操纵子；葡萄糖效应；弱化子；顺式作用元件；反式作用因子；增强子；沉默子； 二，问题： 1.什么是操纵子？以乳糖操纵子或色氨酸操纵子为例描述一下它是如何来调控基因的转录的？ 2. 原

25、核生物与真核生物在基因转录上存在哪些不同点？简单描述真核生物RNA聚合酶II的特点。 3.真核生物的基因包括哪些顺式作用元件？描述真核生物转录因子是如何调控基因转录的？常见转录因子上的DNA结构域有哪些,第十章、基因表达的调控转录调控 一、基因表达调控的概述 二、mRNA的生物合成（转录） 三、原核生物基因转录的调控 四、真核生物基因转录的调控 五、原核与真核生物基因表达调控研究方法学 六、表观遗传,胶迁移电泳分析 Electrophoresis mobility shift(EMSA assay)/凝胶迁移(Gel-shift) DnaseI足迹法 (DNaseI Foot-printing

26、) 3. 甲基化干扰试验(Methylation interference ) (By modification) 4.染色质免疫沉淀(ChIP assay (in vivo) 5.表位标记技术(Epitope-Tagging Technology) (protein complex formation in vivo,DNA-蛋白质相互作用研究实验,1.原理,在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动,分子量越大则所受阻力越大,移动的距离越短。 当DNA与某种蛋白质结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移收到阻滞，朝正电极移动的距离相应就缩短了,凝胶迁移Gel-shift (or

27、EMSA,2.主要步骤及内容,1）制备探针DNA：（P32放射性同位素标记DNA） 2）同纯化蛋白一起温育，形成DNA-蛋白质复合物。 3）加样，进行电泳分离。 4）应用放射自显影技术观察结果，显现具放射性标记的DNA条带位置,Gel-shift (or EMSA,P32,binding site for TF-A (Transcription factor A,/- TF-A,Incubate,Native polyacrylamide gel,+ TF-A DNA-TF-A complex Free probe,凝胶迁移实验不仅可以用来鉴定特异蛋白（如转录因子）与某一特定DNA片段的之间的

28、结合情况，而且利用超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA）可以找出蛋白质在DNA序列上精确的结合位点,mutated binding site or site for another TF,Competed out by excess of unlabeled probe (e.g., 50 x, 100 x or 200 x fold excess,利用竞争DNA发现DNA上精确的蛋白结合位点,Unlabeled competitor with point mutation,shifted probe,Unbound probe,1.原理,当DNA分子中的某一区段与特异的转录

29、因子结合后可以得到保护而免受DNaseI的切割作用， 结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现一个空白区，俗称“足迹”。 如果在电泳时结合DNA化学测序，这可准确判断出结合区的精确序列,DNaseI足迹法(DNaseI Foot-printing,2. 主要步骤及内容,1）同位素标记双链DNA中的一条链 2）加入蛋白质，形成DNA-蛋白质复合物 3）用DNaseI水解DNA 4）尿素变性 5）PAGE分离及放射性显影,关键：控制好DNaseI的用量，使之达到平均每条DNA链只发生一次切割,Footprint,After partial DNase I digestion,Sequencing g

30、el image,Transcription factor,TF-A,P32,Synergistic (co-operative) Binding,Very important in Gene regulation in both prokaryotic and eukaryotic systems Binding of one site facilitates binding of another site,A,B,Double occupancy,Log nM,染色质免疫沉淀(CHIP assay,1.原理： 在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究

31、的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来,2.主要内容及步骤,1）细胞的甲醛固定 2）超声波断裂染色质 3）染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化 4）交联反应的逆转和DNA的纯化 5）染色质免疫沉淀的DNA分析（利用荧光定量PCR检测,Cell， July 25, 2003 ，Vol 114: 255-266,组蛋白基因的转录调控,In human cells,那么，果蝇中的组蛋白转录是如何调控的呢？ 1. 果蝇的Pdm-1蛋白具有高度保守的POU结构域，是否具有转录因子的功能？ 2. 在组蛋白启动子上没有发现规范的 octamer element,利用足迹法证明pdm1 结合在组蛋白启动子上,J. Biol. Chem. 2010, 285:9041-9053,J. Biol. Chem. 2010, 285:9041-9053,凝胶迁移实验进一步证明pdm1 与组蛋白启动子的结合,J. Biol. Chem. 2010, 285:9041-9053,Gel-s