现代分析技术与应用：第十九章 平面色谱法 (3)

1、第十九章 平面色谱法,现代分析技术与应用,1,2,3,平面色谱法的分类和原理,薄层色谱法,本章内容,纸色谱法,特点： 方便、快速、成本较低，易于推广 样品的预处理比较简单 应用范围广 展开剂选择范围宽,平面色谱法：在平面上进行分离的一种色谱方法 薄层色谱法（thin layer chromatography, TLC) 纸色谱法(paper chromatography),概述,第一节 平面色谱法的分类和有关参数,分类（根据操作形式） 薄层色谱法 吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法 分子排阻薄层色谱法 纸色谱法 薄层电泳法,比移值(Rf值) 溶质移动距离与流动相移动距离之比。 定性的基本参数,(一

2、）平面色谱法的参数,被分离物质的结构和性质 平面和展开剂的性质 温度 展开剂蒸气饱和程度 重现性差,影响因素：,定性参数,a、b为原点至斑点中心的距离， C 为原点至溶剂前沿的距离,Rf： 0-1之间Rf=0, 组分在固定相上完全保留Rf=1, 组分在固定相上完全不保留,(一）平面色谱法的参数,定性参数,最佳范围 0.3-0.5 可用范围 0.2-0.8,(一）平面色谱法的参数,定性参数,相平衡参数,分配系数 K= Cs/Cm 容量因子 k K、k与Rf值的关系：,1、不同物质热力学常数K不同，Rf值不同，平面色谱显示不同的斑点 2、0.01K100 3. 利用公式,可进行Rf, K之间的互相

3、换算.,(一）平面色谱法的参数,结论：,(一）平面色谱法的参数,分离参数,固定相： 吸附剂或载体涂布于玻璃板等成一均匀薄层并活化 流动相：有机溶剂 原理：分配、吸附、离子交换、空间排阻、胶束薄层色谱法,第二节 薄层色谱法 (thin layer chromatography；TLC),第二节 薄层色谱法 (thin layer chromatography；TLC),过程:,固定相或载体涂于薄板并活化,点样,密闭容器内用适当溶剂展开,显色后斑点比较,含量测定,定性鉴别,特点： 快，需十至几十分钟，同时展开多个试样 试样预处理简单，对试样限制少 上样量比较大，适用于制备(一定条件下) 仪器简单，

4、操作方便 灵敏度较高 最直观定性观测混合物体系的一种方法,第二节 薄层色谱法 (thin layer chromatography；TLC),分配薄层色谱法 吸附薄层色谱法 分子排阻薄层色谱法,（一）主要类型和原理,（一）主要类型和原理,分配薄层色谱法,固定相：液体 原理：组分分配系数（溶解度）不等多次分配 Rf顺序：分配系数大移动速度慢，Rf值小 分配系数：溶解度，相似相溶原则,分类： 正相色谱：流动相极性小于固定相 水为固定相（硅胶载体），有机溶剂为流动相。极性强的组分K大， Rf值小。 反相色谱：流动相极性大于固定相 烷基化学键合相为固定相，水-有机溶剂为流动相。极性强的组分K小，Rf值

5、大。,（一）主要类型和原理,分配薄层色谱法,固定相：吸附剂 原理：反复（吸附-解吸附） Rf顺序：吸附系数大移动速度慢，Rf小 吸附系数与极性有关，极性大吸附系数大 实验室内硅胶板属该类型,（一）主要类型和原理,吸附薄层色谱法,（二）吸附薄层色谱的吸附剂,1、吸附剂 (1）硅胶：多孔性无定形粉末，表面带有硅醇基而呈弱酸性 原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。 应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等 问题: 胺类等碱性物质是否可以点TLC?,硅胶类吸附剂的分离效率: 1、含水量高，活性级高，活度低。 活化：加热至100左

6、右 2、粒度越小，越均匀，分离效率越高。 常用硅胶： 硅胶H，不含黏合剂 硅胶G，含煅石膏 硅胶GF254，含煅石膏和锰激活的硅酸锌 254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景？(最常用),（二）吸附薄层色谱的吸附剂,碱性氧化铝(pH9.0) 分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等； 中性氧化铝(pH7.5) 分离酸性及对碱不稳定的化合物； 酸性氧化铝(pH4.0) 酸性化合物的分离。 活性与含水量有关，含水量越高，活性越弱。,（二）吸附薄层色谱的吸附剂,氧化铝,氧化铝和硅胶含水量与活性的比较,（二）吸附薄层色谱的吸附剂,聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物质。常用的是聚已内酰胺,聚酰胺可分离

7、极性和非极性物质 如黄酮、酚类、醌类、有机酸、生物碱、萜类、甾体、苷类、糖类、氨基酸衍生物、核苷类等。尤其是对黄酮、酚类、醌类等物质的分离，远比其他方法优越。,（二）吸附薄层色谱的吸附剂,聚酰胺,展开剂 选择原则： 根据被分离物质的极性 Stahl简图： 极性物质活度低（活性级大）的吸附剂-极性展开剂,（二）吸附薄层色谱的展开剂,选择原则,多采用混合溶剂 1、单一溶剂展开 2、Rf值太小，则加入极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等 3、Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等) 4、加入少量酸、碱可抑制某些化合物斑点拖尾，使斑点集中。 5、展开剂中加入中等极性的溶剂（如丙酮）可使不相混合

8、的溶剂混溶、降低展开剂黏度。,（二）吸附薄层色谱的展开剂,选择原则,最佳范围 0.3-0.5 可用范围 0.2-0.8,（二）吸附薄层色谱的展开剂,选择原则,所选展开剂必须使实验者可通过TLC对混合物中各组分有最直观的判断,极性强的溶剂洗脱能力强 常用溶剂的极性强弱顺序： 水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油醚 实验室常用：乙酸乙酯：石油醚混合物 二氯甲烷：甲醇混合物,（二）吸附薄层色谱的展开剂,选择原则,（三）薄层色谱操作方法,制板均匀 点样集中 展开(多种方式) 预饱和 显色,展开,在一个具有一定空间和形状的密闭容器中，流动相沿薄层（固定相）运

9、动。,直立双槽色谱缸,卧式色谱槽,圆形色谱缸,（三）薄层色谱操作方法,展开方式, , ,（三）薄层色谱操作方法,展开过程中注意溶剂蒸气饱和 展开剂高度不超过0.5厘米 原点不可浸入展开剂中,同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，这种现象称为边缘效应 展开剂的蒸气饱和程度影响样品的色谱行为，尤其在使用混合溶剂时更为突出 展开剂蒸发速度中央到两边增加 密闭容器，先用溶剂蒸气饱和,边缘效应,（三）薄层色谱操作方法,有色物质 日光下观察 有紫外吸收 紫外灯下观察 在254光下呈现暗斑 无色物质 喷洒显色剂（碘、硫,（三）薄层色谱操作方法,斑点的定位（确定斑点位置）,酸溶液、荧光黄

10、溶液）,紫外显色最常用，大共轭体系365波长下有荧光 不同类型物质显色方法不一样,色谱法概论: 色谱峰混合物中最小组分数 薄层色谱： 斑点数混合物中最小组分数 斑点位置不同Rf不同化合物不一样 反之，斑点相同化合物一样是否成立？ 比移值Rf:定性分析的基本参数,定性分析,（三）薄层色谱操作方法,（三）薄层色谱操作方法,定性分析,应用1：反应终点及进展情况判断,催化剂：,反应结束后体系内待分离物质：,硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强,硅胶柱走出顺序：,反应结束后体系内待分离物质：,TLC是硅胶柱纯化混合物的基础。 作用：判断混合物组分，选择合适洗脱剂,E:P 1：10,M:C 1：10,E:P

11、 1：100,（三）薄层色谱操作方法,定性分析,应用2：常采用已知标准物质对照（同一板上展开），多种展开系统的Rf值与对照品一致。,（三）薄层色谱操作方法,定性分析,应用3：与文献中已知物质的相对比移值进行比较定性 应用4：斑点与显色剂反应生成有色斑点初步推断化合物类型 应用5：杂质检查和主组分自身对照,（三）薄层色谱操作方法,定性分析,洗脱法 薄层色谱分离选用合适溶剂将斑点中组分洗脱下来。再用适当的方法定量测定。 斑点需预先定位 常用：,定量分析,薄层色谱法,展开确定物质组分选择需要物质刮下所需色带硅胶粉乙酸乙酯等溶剂洗脱硅胶粉除去溶剂得分离后产物,直接定量法 1.目视比较法 与已知浓度对照

12、品容易比较，斑点颜色深度或面积大小 2.薄层扫描法 扫描斑点对光吸收的强弱,薄层色谱法,定量分析,薄层色谱扫描法： 用一定波长的光束照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸光度A（或荧光强度F）随展开距离a的变化，所记录的A-a（或F-a）曲线 利用薄层扫描图进行定量及定性分析 常用：双波长薄层扫描仪,薄层扫描法简介,s 选用被测组分的最大吸收波长， R选用不被被测组分吸收的波长（薄层板的空白吸收）。 由于从测量值中减去了薄层本身的空白吸收，所以在一定程度上消除了薄层不均匀的影响，使测定结果准确度提高。,双波长法扫描,薄层扫描法简介,图16-10 双波长双光束薄层扫描仪 图16-11 双波长测

13、定法 L：光源 MC：单色器 CH：斩光器 、为单波长扫描曲线 P：薄板 PM：光电检测器 为双波长扫描曲线,薄层扫描法简介,双波长法扫描,扫描方法,透射法与反射法 线形扫描曲折形扫描,薄层扫描法简介,薄层扫描法简介,散射参数的选择 荧光测定法 定量分析法,薄层色谱,判断反应终点，监视反应过程。 各种天然和合成有机物的分离和鉴定，有时也可用于小量物质的精制。 可用于药品质量监控中药物纯度测定及降解产物检查。 鉴别中药和中成药有效成分及进一步含量测定。,固定相 纸纤维为载体，吸着在其上的水为固定相 流动相 含水的有机溶剂 原理 依据分配系数的不同而达到分离，属于正相分配色谱,第三节 纸色谱法,概述,比移值Rf表示组分在色谱中的位置 分配系数：与化合物的分子结构、流动相的种类、极性有关。 流动相一定： 极性越大或亲水性越强，分配系数越大， Rf越小。,纸色谱法,分离原理,实验条件,色谱纸的选择 1、滤纸质地均匀，有机械强度 2、松紧适宜 3、纸质纯，无明显荧光斑点 4、Rf值相差很小的化合物，慢速滤纸，反之则快速滤纸 5、制备或定量，用厚纸,纸色谱法,固定相 滤纸纤维，20-25%水分，6%-7%水以氢键缔合形式与纤维素的羟基结合。 特殊物质需预处理 酸碱物质分离：pH缓冲液中浸渍 弱极性物质：甲酰