基因工程：第四章-酵母基因工程

1、酵母基因工程,酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗,1996 完成第一个真核生物-酿酒酵母全基因组测序。,Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。,1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。,1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。,1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。,（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征,酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方

2、式进行无性繁殖的单细胞真核生物。,如果说E.coli是外源基因最成熟的原核生物表达系统，Yeast则是最成熟的真核生物表达系统。,酵母菌表达外源基因的优势：,全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传操作简便。,具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。,大规模发酵工艺简单、成本低廉。,不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。,能将外源基因表达产物分泌至培养基中。,表达产物的糖基化位点和结构特点与高等真核生物有差距。,酵母菌表达外源基因的缺点：,（二）酵母菌的宿主系统,用作模式真核生物的酵母宿主菌 用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化

3、作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌,1、用作模式真核生物的酵母宿主菌,基因表达调控机理与高等真核类似。,酿酒酵母(Saccharomyces cereviasiae)：,无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物；,繁殖方式与原核类似，易于操作；,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：,最成熟的真核细胞表达系统； 表达水平低； 产物过度糖基化。,2、用于外源基因表达的酵母宿主菌,巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris) 多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha),甲醇酵母：,可利用甲醇作为唯一

4、碳源； 表达水平高； 产物糖基化更合理。,特点：,乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) 非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),其它酵母：,已有60多种酵母菌建立了转化系统。,酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。,3、提高外源蛋白表达产率的突变宿主菌,能提高外源基因表达或分泌的突变类型,改善外源蛋白分泌 提高外源基因表达 提高外源基因表达 提高外源基因表达 改善外源蛋白分泌提高外源基因表达,突变类型 生物效应 作用位点,ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho,钙离子依赖型ATP酶 转

5、录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平,如： rho突变株中人溶菌酶表达量提高10倍。,4、抑制超糖基化的突变宿主菌,措施：构建超糖基化缺陷突变株。,酵母菌普遍拥有蛋白质糖基化系统，但野生型酵母菌对外源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向。,抑制超糖基化的突变类型,mnn 甘露糖生物合成缺陷 alg Asn侧链糖基化缺陷 och 外侧糖链添加缺陷,突变类型 生物效应,如：人1-抗胰蛋白酶、人tPA在酿酒酵母 mnn9和och1突变株中高活性表达。,5、减少泛素依赖型蛋白降解的突变宿主菌,泛素介导的蛋白质降解作用,酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因：,UBI1 编码泛素-羧基延

6、伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7,泛素降解途径衰减的酿酒酵母,UBI4缺陷型：,在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达。 UBI4突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株低得多，是外源基因表达的理想受体。,UBA1缺陷型：,UBA1编码泛素激活酶E1，是一种看家基因。 UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性

7、的，且能削弱泛素介导的蛋白降解。,UBC4-UBC5双突变型：,UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛素介导的蛋白降解。 7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。,6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌,酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和pep4-3突变株 B-半乳糖苷酶活性明显升高,（三） 酵母菌的载体系统,酵母附加型质粒（YEp） 酵母复制型质粒（YRp） 酵母着丝粒质粒（YCp) 酵母人工染色体（YAC） 酵母整合型质粒（YIp）,2质粒（酿酒酵母）,人工构建质粒：,野生型质粒：,除酵母外，其它几种酵母的细胞内也含有野生型的相似质粒。 结合酵母属：pSR

8、1、pSB1、pSB2 克鲁维酵母属：pKD1,酿酒酵母中的2环状质粒：,RAF,野生型，双链、环状，6318bp，拷贝数50-100。,REP: 编码产物控制质粒稳定性 STB: REP结合位点,含有多个单一酶切位点，便于克隆操作；,人工构建酵母质粒的共同特点：,含有E.coli质粒复制起点，便于克隆操作；,含有在酵母和E.coli中进行选择的双标记；,除YIp型质粒外均为穿梭载体。,YEp质粒：,复制子：源自2质粒；,拷贝数：50-100；,不稳定：培养几代后，质粒丢失率高达50-70%，主要由于分配不均匀所致。,YRp质粒：,不稳定：培养几代后，质粒丢失率高达50-70%，主要由分配不均

9、匀所致。,拷贝数：50-100；,YCp质粒：,拷贝数：1-5。,在YRp中引入CEN； CEN：着丝粒，源自酵母3号染色体，有丝分裂稳定，拷贝数低。,复制子：源自酵母染色体 的ARS；,YAC质粒：,用于大型基因文库构建。,在YCp中引入TEL； TEL：端粒，酵母染色体末端序列，利于线性DNA末端稳定；,稳定性随着插入DNA片段的增大而增加；,YIp质粒：,拷贝数：通常为1,只有E.coli的复制子；,引入酵母基因组的同源序列：以标记基因his3 5和3端作同源序列；,载体以同源重组方式，整合入酵母基因组；,（四）酵母菌的转化系统,转化质粒在酵母细胞中的命运,酵母菌的转化方法,用于转化子筛

10、选的标记基因,酵母菌的转化方法,原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电击转化法,原生质体转化法,在Ca2+和PEG存在下，转化子可达原生质体总数的1-2%。大多数需要标记基因筛选转化子。,对线型和环状DNA的吸收没有特异性。,1个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%；,原生质体转化法的缺点：,转化率受原生质再生率的严重制约。,操作周期长；,2）碱金属离子介导转化法,酵母菌完整细胞经碱金属离子(如Li+)、PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍。,共转化现象极为罕见；,3）电击转化法,适用范

11、围广。,酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下吸收质粒DNA。不使用PEG。,转化率高；,操作方便；,转化质粒在酵母细胞中的命运,1）单、双链DNA均可转化酵母菌，单链的转化率是双链的10-30倍。,2）含复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。,3）不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对体内定点突变酵母基因组极有利。,4）克隆在整合型质粒YIp上的外源基因，若含受体细胞染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子的50-80%。,用于转化子筛选的标记基因,营养缺陷型互补基因 显性基因,宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变 如：LEU-、TR

12、P-、HIS-、URA-,营养缺陷型互补基因,载体：携带相应的合成基因 如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3,选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基,显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。,显性标记基因,（五）酵母菌的表达系统,酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统,1、酿酒酵母表达系统,酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母密码子的偏爱性 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统存在的问题,1）酿酒酵母系统启动子,UAS：上游激活序列 TATA盒：富含AT URS：上游阻遏序列 DAS：下游激活序列,甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH) 磷酸甘

13、油激酶基因(PKG) 乙醇脱氢酶基因(ADH),酿酒酵母表达系统常用启动子：, 糖酵解途径中关键酶的强启动子，受 葡萄糖诱导：, 半乳糖激酶启动子(GAL1),野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差。,GAL1、GAL7和GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控；,GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录；,半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1、GAL7、GAL10等高效转录。,PGAL10,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,将GAL4的启动子换成GAL

14、10的诱导型强启动子；,PHO5启动子在培养基磷酸盐耗尽时，启动转录；,pho4TS 温度敏感，35时失活，PHO5关闭；,pho4TS-PHO5启动子通过降温(23)诱导表达。,pho4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子；, pho4TS-PHO5启动子,严紧控制型启动子,对雄激素具有应答能力的启动子 以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有效的将外源基因的表达水平控制在一个合适的范围内。 雄激素受体表达水平 、雄激素浓度 、重组质粒拷贝数三者之间平衡有效作用于启动子 外源基因水平控制在高于基底水平1400倍范围,2）酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中，高丰度蛋白质96%以上的氨基

15、酸由25个密码子编码，如：,它们对应于异常活跃的高组分tRNA, 而低组分tRNA基本上不会被使用。 酵母tRNA与外源基因的密码子的不匹配性，影响了异源mRNA的翻译速率，更重要的是降低了mRNA的结构稳定性。,酵母蛋白质的分泌运输机制,多肽性激素因子：MF- 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL,3）酿酒酵母分泌系统,酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：,酿酒酵母信号肽特点：,保守性低，大多异源宿主系统的信号肽 不能互用；,“-3-1规律”,MF-信号肽：,分泌效率高；,在酵母系统具有通用性；,除了信号肽以及其构象特征外，受体细胞内信号肽剪酶系的表达水平对异源蛋白的高

16、效分泌也有很大的影响。 异源蛋白的性质不同，信号肽序列的效率也不一样，只有异源蛋白一致的情况下比较信号肽的效率才有意义。,对Thr/Ser的羟基氧进行糖基化。,4）酿酒酵母糖基化系统,糖基化位点：Asn天冬酰胺-X-Thr/Ser （X代表任何氨基酸）,对Asn的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。,O型糖链仅由甘露糖组成（哺乳动物细胞的还含唾液酸基团）。,酵母菌糖基化特点：,N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的复杂分支结构，会增加免疫原性、影响活性和药代稳定性。,过糖基化：,糖链组成：,5）酿酒酵母表达系统的缺陷,不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵。,表

17、达载体传代不稳定（YEp、YRp）；,所采用的强启动子调控不严谨；,2、甲醇酵母表达系统,甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策,1）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇酵母（methylotrophic yeast)： 可利用甲醇作为单一碳源的一类酵母。,巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris) 多形汉逊酵母（Hansenula ploymorpha) 博伊丁假丝酵母（Candia boidinii),甲醇氧化酶：,甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上；,AOX1占主导地位，负责AOX 99%以上活性。,AOX

18、1与AOX2：,毕赤酵母和假丝酵母基因组中存在2个AOX基因：AOX1、AOX2；,AOX1与AOX2基因97%同源；,甲醇氧化酶启动子：,目前已发现的、最强的真核启动子；,当甘油被消耗尽时，加入甲醇，诱导重组蛋白的表达。,毕赤酵母的发酵过程：,成长期：,诱导期：,过渡期：,以甘油为碳源，目的是收获一定的菌量。,不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除其对AOX1启动子的阻遏。,优点：,AOX1启动子是目前最强、调控机理最严格的启动子之一，甲醇可严格调控外源基因表达；,2）甲醇酵母表达系统的优缺点,表达水平高；表达HBsAg50倍于酿酒酵母,产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、脂酰化；,实验室和工业操作

19、简单。,产物可正确折叠和高效分泌；,过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150个甘露糖）；,可利用简单无机盐培养基高密度发酵；,不能满足结构要求严格的糖基化；,缺点：,载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。（多拷贝整合）,3）甲醇酵母表达系统操作原理,宿主菌株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达载体,宿主菌株与标记基因,二大宿主系统主要特点,毕赤酵母 汉逊酵母,最适温度 30 37 最适pH值 4.5 4.5 甘油阻遏 是 否 糖基化 部分过度 较正常 高密度发酵 100g/L 100g/L,二大宿主系统主要选择标记,宿主 选择标记,毕赤酵母 his4、G418

20、、Zeocin、Cu2+ 汉逊酵母 leu2、his3、ura3、G418,毕赤酵母系统主要宿主菌,Mut表型与甲醇利用率,甲醇酵母系统的整合事件,YRp型载体： 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。,主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合。,YIp型载体：,在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组；,有两种整合模式：插入、取代；,毕赤酵母系统 模式表达载体,5AOX1启动子片段含AOX1启动子，在甲醇诱导下可启动外源基因表达；,MCS为外源基因的插入位点；,信号肽序列使外源蛋白分泌到发酵上清中，便于纯化；,TT提供转录终止和polyA修饰信号；

21、,HIS4为营养缺陷型筛选标志，能与 酵母染色体his4基因同源重组；,3AOX1基因片段能与酵母染色体AOX1基因同源重组；,Amp为载体在E.coli中的筛选标志；,f1 ori为丝状噬菌体的复制起点。, AOX1位点插入,载体的3AOX1区与酵母基因组AOX1基因的末端发生整合重组。, His4位点插入,载体的HIS4区与酵母基因组HIS4基因的末端发生整合重组。, 多基因插入事件（串联整合）, 基因取代（GS115，AOX1+）,甲醇酵母系统胞内表达载体,胞内表达与分泌表达载体,甲醇酵母系统胞内表达载体,甲醇酵母系统分泌表达载体,信号肽：PHO1,甲醇酵母系统分泌表达载体,信号肽：MF

22、-,pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点,4）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策,载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA 5端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性, 载体稳定性,采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚。,同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。,YRp型载体的稳定化： 选择-非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时、整合位点不确定。, 基因剂量,构建高拷贝整合型表达载体。,外源基因表达存在基因剂量效应。,筛选多拷贝整合子 载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。,体外串联多个表达盒

23、，直接获多拷贝整合子；,采用YRp型载体稳定化技术，获高拷贝整合子；, 整合位点,毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低。,外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达；, 甲醇利用表型,在分泌表达情况下，甲醇利用慢型（Muts）更利于表达。, mRNA 5端,应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构。,mRNA 5端非翻译区（UTR）的组成与长度应尽量与AOX1/MOX的一致； AOX1基因5-UTR长114nt，富含A+U，其编码的乙醇氧化酶表达量极高。, 基因序列的AT含量 AT含量越高，越容易出现类似于终止子的结构。,对A+T含量丰富的基因，最好重新设

24、计序列，使其(A+T)含量在30-55范围内。这种方法使人血清白蛋白(HAS)的表达量提高50倍。, 分泌信号,可采用酿酒酵母来源的MF-、PHO或SUC等的信号肽，或野生型信号肽，但要比较分析适用性。,分泌表达效率与所用信号肽密切相关；,采用蛋白酶缺陷宿主株： 如P.pastoris SMD1168。, 表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素。,降低培养基pH值： 蛋白酶在酸性条件下活性较低。,向培养基中添加蛋白胨或酪蛋白水解物： 竞争性抑制蛋白酶活性。,目前，20余种重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中成功表达，如：人血清白蛋白(HSA)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子

25、(TNF)、表皮生长因子(EGF)等。,数种重组蛋白在多形汉逊酵母表达系统中成功表达，如HBsAg。,（六）利用重组酵母生产乙肝疫苗,乙肝病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,由乙肝病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重传染病，每年约200万病人死亡，3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌。,利用酵母大规模生产乙肝疫苗为其应用提供了保证。,目前对HBV还没有一种有效的治疗药物，乙肝疫苗可有效预防病毒感染。,HBV的结构与性质,HBV是蛋白包裹型的双链DNA病毒，有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径42nm，基因组3.2

26、kb。,HBV的结构：,病毒颗粒主要结构蛋白是病毒表面抗原 (HBsAg)；颗粒内蛋白包括核心抗原(HBcAg)、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。,HBsAg：HBV包膜糖蛋白，包括小分子(S)、中分子(M)、大分子(L)表面抗原三种形式。,HBsAg编码基因：,ATG,ATG,ATG,TAA,108aa,55aa,226aa,preS1,preS2,S,S蛋白,226aa,M蛋白,281aa,L蛋白,399aa,S蛋白可刺激机体产生中和抗体，是制备乙肝疫苗的主要成分。,S蛋白： 即小分子HBsAg，是构成HBV包膜的主要成分，大量存在于感染者血清中，是感染HBV的主要标志。,HBV在体外细胞培养基中不能繁殖，第一代乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取的。 质膜来源的疫苗有较高的免疫原性，但受原材料限制，难以产业化。,传统乙肝疫苗的制备：,