结核病诊断T-SPOT 实验【讲座资料】

1、汇 报 人： 培训专业：呼吸内科 指导老师： 2016.12.14,02,结核病实验室检查及意义,目录,01. 分枝杆菌概述,02. 结核病实验室检查,03. 小结,2,分枝杆菌概述,01,3,分枝杆菌属分类,结核分枝杆菌(M.tuberculosis) 非结核分枝杆菌（NTM） 麻风分枝杆菌（M.leprae）,4,结核分枝杆菌的发现,1882年 德国柯赫医生发现结核致病菌-结核杆菌,5,结核杆菌的变迁,1897年提出结核病的飞沫传播 1922年，卡介苗为预防结核病首次对新生儿接种 1945年，链霉素的问世使肺结核不再是不治之症。 ,6,结核分枝杆菌特点,(M.tuberculosis),生

2、物学主要特点： 1. 细胞壁中含有大量脂质 2.引起的疾病都呈慢性 并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性,7,结核病,由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病,8,结核病临床表现,9,结核病发病机制,起始期,细胞外增殖期和传播期,共生期,T细胞反应期,10,结核病发病机制,11,结核病发病机制,12,活动性结核与潜伏感染,13,结核病诊断,实验室检查,影像检查,病理检查,+,临床 指征,14,结核杆菌实验室检查,02,结核诊断-临床应用,几乎所有的临床内科科室都需要结核的鉴别诊断： 发热待查，结核排筛 结脑的鉴别诊断 胸腹水患者待查 儿童结核,16,结核杆菌,结核病 实验室检查,细菌学检查,免疫学检查,分子

3、生物学检查,分枝杆菌分离培养 分支杆菌药敏试验 分枝杆菌菌种鉴定,体液免疫学诊断,细胞免疫学诊断,DNA测序 DNA探针技术 聚合酶链反应（PCR）,17,结核分枝杆菌-实验室检查,涂片镜检,细菌学检查,适用于多种标本；操作简便，价格低廉。 2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性； 1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。 肺结核治疗评估的主要依据之一,18,结核分枝杆菌-实验室检查,缺点：不能区别是否为非结核分枝杆菌 不能区别死活菌。 结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。 检测灵敏度较低（104-105 个细菌/毫升）。,19,结核杆菌培养,

4、细菌学检查,传统方法：L-J固体培养基 快速培养法: 检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2，显微镜直接观察、变色液体培养基等BACTEC MGIT960系统 BACTEC460系统、Bact/ALERT 3D、ESP等。,痰培养、其他标本培养,20,结核杆菌培养,阴性培养,阳性培养,BACTEC MGIT 960/320 指示器系统,21,结核杆菌培养,1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+ 1份痰标本结核分枝杆菌培养 痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性,用于耐多药结核疗效判定,结核菌培养临床价值确诊结核,22,抗酸杆菌培养优缺点,敏感

5、性较直接涂片法高，理论上10-100条菌/毫升可检出阳性； 特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌； 分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。,需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。 结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响， 操作较直接涂片法复杂，需经严格培训 。 需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备。 成本是直接涂片法的7-8倍。,23,细胞免疫学检查,结核菌素皮肤试验（PPD试验） 干扰素释放试验（T-SPOT试验）,24,免疫学检查,细胞免疫学检查,PPD-结核菌素试验,迟发型细胞

6、超敏反应 1）方法：1:2000 OT或PPD液0.1毫升(5单位)，左前臂屈侧中部皮内注射，48-72h测量皮肤硬结的直径。,25,PPD-结核菌素试验,2）判断标准： 阴性4mm 弱阳性5-9mm 阳性10-19mm， 强阳性20mm 或局部出现水泡与坏死,26,PPD-结核菌素试验,3)结核菌素试验的意义 阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。 阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。 强阳性：活动性结核病可能,A、变态反应尚未建立；B、免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等,27,PPD-结核菌素试验,PPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他

7、分枝杆菌感染的影响，特异性较差。 当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果，敏感性低。 免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。 经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但存在着明显的缺陷。,PPD试验临床价值,28,T-SPOT实验,细胞免疫学检查,T-SPOT试验原理,结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到 结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。 因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。 既用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式 将其表现出来。 刺激抗原：ESAT-6蛋白(早

8、期分泌抗原靶6） 、CFP-10蛋白（培养滤液蛋白） 由结核分枝杆菌特有的RD1基因编码，可刺激活化的效应T淋巴细胞产生干扰素。 RD1基因在BCG以及大部分环境分枝杆菌中缺失。,29,T-SPOT试验,30,T-SPOT步骤,31,T-SPOT灵敏度,灵敏度 基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655),32,结核杆菌,特异性高 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据

9、：特异性94.1%(478/508),33,PPD皮试与T-SPOT试验,PPD皮试和T-SPOT试验的比较,34,T-SPOT试验结果解释,阴性结果 提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果： 感染阶段不同；少数免疫系统功能不全/疾病；实验非正常操作。 阳性结果 提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果： 4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登） 减少了医生主观因素对检测结果的影响;

10、故虽然检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病早期诊断的较为理想的手段。,35,非血液样本检测,T-SPOT可通过一些体液成功地诊断出活动性结核： 支气管肺泡灌洗液（“BAL”）（肺部） 脑脊髓液（“CSF”）（中枢神经系统） 胸腔积液（肺部周围） 腹膜液（腹腔） 非血样本的T-SPOT结果很强的话（即存在大量的结核效应T细胞）,揭示在这个器官或部位存在活动性结核 非血样本中不存在结核效应T细胞，说明这个器官或部位没有活动性结核,36,各国对潜伏感染风险人群的筛查指南,37,小结,03,小结,结核病诊断金标准： 抗酸杆菌培养-阳性 病理结果-阳性,辅助手段： 影像学、分子生物学,结

11、核病在临床上仍不容忽视，但诊断仍存在难题,T-SPOT是结核病早期诊断的较为理想的手段,39,参考文献,韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健.-干扰素释放分析T-SPOTTB在结核性疾病中的诊断价值.临床肺科杂志.2012,17(8):1439-1440 张丽帆，刘晓清.干扰素释放分析T-SPOT.TB诊断结核感染临床应用进展.中国医学科学院学报.2009,4:506-510 中华人民共和国卫生部，肺结核诊断标准，2008-08-01 Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011. Connell et al PLoS ONE 2008. 3;