免疫组化的原理与操作

1、,Immunohistochemist,ry,概念：,免疫组织化学,(Immunohistochemistry,IHC),是,利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织,和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学,和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也,叫原位免疫学（,In situ immunology,）。,特点或优点：,（,1,）特异性强、灵敏度高；,（,2,）可定性、定位、定量观察；,（,3,）将形态学改变与功能和代谢变化结,合起来；,免疫组化概述,IHC,不仅具有传统形态学（包括,LM,和,EM,水平）,能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别,是经苏木精或伊红复染后

2、），而且还克服了传统免,疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能,定位的缺点。,IHC,则可在原位和固相对染色结果进,行观察。目前,IHC,的定位可精确到亚微结构水平。,随着,IHC,技术的发展和图象分析技术的发展，,IHC,已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，,使,IHC,在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不,仅用于研究，也用于诊断。,IHC,与核酸分子杂交相,结合形成的原位杂交技术（,in situ hybridization,，,ISH,）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。,IHC,技术源于免疫荧光术（,immunofluorescence,IF,），从,1941,年,1

3、950,年,Coons,等用了,10,年首创了,荧光素标记抗体技术,检测肺组织内的肺炎双,球菌，六、七十年代,IF,在科研中占据着主导地位,1968,年中根一穗（,Nakane,）等创建了,酶标抗体技,术,（,immunoperoxidase,，,IPO,）,铁蛋白标记,Ab,技术,;,1974,年,Stemberger,改良上述技术，建立,辣根过氧,化物酶抗体过氧化物酶,（,PAP,）技术，使免疫,细胞化学得到广泛应用；,一、,IHC,的发展简史,80,年代,Hsu,等建立了,ABC,法,之后，免疫金银染色,法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。,90,年代,分子杂交技术、原位杂交技术、免

4、疫细,胞化学分类方法迅速发展；,2000,年,各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组,化技术成为当今生物医学中形态、功,能代谢综合,研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个,学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技,术之一；,国内起步晚，从,70s,开始。,（一）方法学,1.,从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）,亲和反应。新的亲,和物质对有：,生物素与卵白素,（,biotin,四乙基罗达明（,rho,damine,RB200,）,-,荧光显微镜下发橙红色荧光,酶,：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。,生物素,：（,Biotin,）,铁蛋白金,等：主要应用于免疫电镜。,其他：如同位素（因涉及污染和防护

5、难一般不用）,（四）,IHC,的应用,1.,只要是形态科学均可采用,:,包括病理学、神经科学、,生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫,等）、皮肤病学、器官移植等。,2.,可用于多种材料：,A.,各种组织（冰冻组织、,formalin,固定组织、石蜡包埋组织兼可）；,B.,各种细胞,(,穿刺、,体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。,3.,用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。,4.,用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研,究生常用,IHC,，或,IHC+,分生技术；,最近几年，分子,生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，,用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，,进而深入研究

6、其功能。,（一）标本的收集与处理,IHC,染色成功与否及其质量如何，除染色方法本,身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、,固定、脱水、包埋、切片等。,目的：保存好,Ag,的数,量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。,材料的,来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固,定的。,1,、组织标本的取材与储存,来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。,要求：要快、要小（,1,1,0.4cm,），避免挤压。,处理：冰冻,即用或保存；固定,即用或保存。,三、样品的准备、处理,2,、细胞标本的取材与储存,来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。,处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；,细胞少需离心

7、沉淀、涂片、干燥、固定、染色；,对于体外培养细胞：,贴壁生长,细胞（内皮,C,、纤,维,C,、神经,C,等）在培养皿底置载玻片；,悬浮生长,细胞,需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。,（二）固定（,fixation,）,1,、固定的含义,固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性,）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免,Ag,溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结,构。,根据,Ag,对固定剂的耐受性，可将其分为：,不稳,定,Ag,（如细胞表面,Ag,，不耐甲醛，宜用丙酮）、,半,稳定,Ag,及稳定,Ag,，后二者多为蛋白、肽类、酶类物,质。,固定有时间性，太短达不到固定目的，太

8、长交联,过度，封闭,Ag,。,2,、常用固定剂及其用途,1. 10%,的,formalin,（,4%,的甲醛,formaldehyde,）：以,pH7.4,的,PBS,配制，,优点,：穿透力强、固定快、组织收缩小；,适于,固定蛋,白、肽类、酶、糖。,IHC,常用,4%,多聚甲醛,polyformaldehyde,灌注固定及后固定，,时间,46 h,。,2. 2.5%,的戊二醛，同上。也可用,2%,戊二醛与,2%,多聚甲醛混合,液固定，尤对,超微结构,保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭,抗原，必要时需抗原修复。,3. 70%,的酒精（乙醇），,优点,：固定蛋白好，,缺点,：组织收缩,严重；,时间,

9、：,2h,。,4. 70%,丙酮，,优点,：渗透快；,缺点,：对形态保存不好；,用于,对,冰冻切片和细胞涂片的固定；,时间,：,10min,。,5.,混合固定液：,Bouin,液：,40%PF250ml,、冰醋酸,50ml,、饱和苦,味酸,250ml,；还有,PLP,固定液，较适合免疫组化。,6.,四氧化锇（,OsO,4,锇酸）：常用,PBS,配制,1%,锇酸溶液后固定,1h,，用于免疫组化及电镜观察。,有强烈刺激，需在通风橱内,操作,。,（三）,组织的脱水、浸蜡、包埋和切片,前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片,不需此步骤。,切片可分为：,石蜡切片,：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,57m

10、,；,冰冻切片,：浸糖，,20%30%,蔗糖,4,o,C,过夜，减少冰,晶；,OCT,包埋；液氮速冻，减轻组织破,坏。病理切片要薄，,57 m,；脑片通常,3050 m,厚。,振动切片,：不需做任何包埋，固定后的组织可直接,用振动切片机做各种厚度的切片，并在,染色后可进一步制作电镜标本观察。,（四）防脱片剂,（,1,）,蛋白甘油，蛋清与甘油,1,：,1,搅拌、过滤、防腐；,（,2,）,1%,的铬矾明胶涂片；,（,3,）,0.1%,的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。,配制时用塑料,瓶而不能用玻璃瓶,；,（,4,）,购买商品化的进口,硅化玻片,；,（,5,）,APES,（氨丙基三乙氧基硅烷），,1,：,

11、50,丙酮稀释，,浸片,2030,秒，晾干备用；,贴片时要一步到位。,（五）抗原修复,近年兴起的新技术。目的：,暴露被交联封闭的,Ag,。,主要适用于经长期,formalin,固定的标本、石蜡包埋标,本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：,（,1,）,微波加热,切片煮沸,1020min,，室温自然冷却，,所用溶液有：饱和,NaCL,溶液；,10mMpH 6.0,的,枸橼酸钠缓冲液；,4M,的尿素等；,pH8.0TBS;,（,2,）高压锅处理,将切片放入,10mM,、,pH 6.0,的枸橼酸,钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气,310min,，自然冷,却。,（,3,）酶消化处理,：常用,0.1%,的胰

12、蛋白酶（含,0.1CL,2,，,pH 7.8,）,37,。,C 10min,。或,0.4%,胃蛋白,酶,37,。,C 30min;,（一）基本染色方法,荧光素标记抗体：,FITC,、,直接法,TRITC,等,标记抗体法,酶标记抗体：,HRP,、,AP,等,荧光素标记抗体,间接法,酶标记抗体（三步法）,非标记抗体法：,酶桥法、,PAP,法,、,APAAP,法,;,亲和组化法：,ABC,法,、,LAB,法、,LsAB,法、,BRAB,法,;,双重标记：,阻断法（酸洗抗）、非阻断法（连续染）,四、免疫组织化学技术,1,直接法,荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗,体与抗原结合（在切片上）荧光显

13、微镜下观察,检测抗原。,优点,：简单，时间短，,特异性强。,缺点,：灵敏度低，所,需抗体量大,（不经济）。,应用,：基本不用了！,2,间接法,荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的,IgG,抗体）。,显色后镜检,特点：,1,、敏感性较直接法高,3-4,倍，但,特异性较低,；,2,、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；,3,、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用,PBS,代替一抗做空白对照。,3,非标记,Ab,桥法：,“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，,其二抗为未标记桥抗体。,（,1,）单桥法,(2),双桥法,在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，,可增大染色强度。,特别提示：注意

14、动物种属关系,特点：,敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非,特异性结合的酶不易洗去，背景染色重,。,4,过氧化物酶抗过氧化物酶法（,Peroxidase anti-,peroxidase method,，简称,PAP,法）,是桥法的改良，用第二抗体作“桥梁”，先与第一抗体结合，,再与,PAP,复合物联结，形成,抗原抗体抗,IgG,抗体,PAP,复合物,，最后用底物显色剂显色。,特点：,灵敏度高，比间接荧光法敏感,20,倍，比间接酶标记抗体法,敏感,100,倍,5,亲和素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物法（,avidin-biotin-,peroxidase complex technique

15、,，简称,ABC,法）。,关键的程序步骤为,3,步：,Ag +,Ab1,+,（,Ab2-B,）,+,AB,C,复合物,（,Ab2-B,为生物素标记的第二抗体）,（,B,为生物素标记的过氧化物酶）,AB,C,复合物是,avidin,与酶联,biotin,在使用前,30min,配置，混匀。,1,个,avidin,分子结合了,3,个,biotin,分子，剩下,1,个结合点与,2,抗的生物素结合，,avidin,起桥联作用。,（,1,）,ABC,复合物的制备：,（,2,）,ABC,法反应原理：,特点：,ABC,法敏感性更高，比,PAP,法,敏感,2040,倍，背景也更清晰。,ABC,法示意图,染色结果

16、观察（,BrdU,）,6,、酶标亲和素,-,生物素技术（,labelled avidin-biotin technique,，,简称,LAB,法）。,即用辣根过氧化物酶直接标记,avidin,，用,biotin,标记,2,抗。,关键步骤为,3,步：,Ag +,Ab1,+,（,Ab2-B,）,+,A,（,A,为,HRP,标记的卵白素）,A,与,2,抗的生物素结合，,avidin,起桥联作用。,如将该法中的,卵白素,（,avidin,）变换成,链霉卵白素,(streptavidin),，,LAB,法即成,LsAB,法，或称,SP,法,。,据认为,LAB,法比,ABC,法敏感,24,倍，而,LsAB

17、,法因,链霉卵白,素,不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在,SP,法,已趋于取代,ABC,法而广为应用。,生物素化抗,AB,复合物,酶标链卵白素,Avidin,Biotin,Peroxidase,抗,组织抗原,ABC,法（,3,步完成）,LsAB,（,SP,）法（,3,步完成）,链霉卵白素,酶,生物素,底物,抗原,SP,法示意图,（二）免疫组化染色步骤（以,ABC,法为例）,1),、,切片常规脱蜡至水：,二甲苯虽然可以反复使用，但次数,不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。,2),、,灭活内源性酶：,博士德推荐应用,3%,的双氧水，但实际操,作中，使用,30%,双氧水和纯甲醇

18、按,1:9,的溶剂比混合较为理想。,3),、,抗原修复：,暴露被交联封闭的,Ag,。,4),、,正常山羊血清封闭：,封闭时应该注意室温与时间的相对,关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反,应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是,如此。,5),、,一抗反应：,一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度,与背景有直接关系。一般说来，阳性染色强度不够时，可提,高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。,孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关,键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温,控制较为困难，,建议,4,冰箱过夜（,18h,）。,6),、,二抗（

19、生物素化,IgG,）反应：,建议湿盒内,37,O,C1h,，另外仪,器显示温度,37,，但实际只有,23,，自然结果难以令人满意。,7),、,SABC,染色（,37,）：,这是博士德的人性化之处，直接就,可以用。,8),、,DAB,显色镜下控时：,DAB,浓度应该比推荐的要低一些，这,样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注,意，使用后残余的,DAB,应,妥善处理,，而不是随便倒入下水道，,因为它有致癌性。,9),、,苏木素轻度复染：,不建议使用。尽管复染后标本层次分明，,但实际情况是，这样有时也会掩盖阳性结果，从而使前功尽弃。,10),、,脱水透明：,脱水乙醇的浓度由低到高，有

20、一个较准确判断,脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发,现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间,不要太长，,1,分钟左右就可以了。,11),、,封片：,封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。,（三）免疫组化染色基本技术及注意事项,1,实验计划,根据课题的内容选用动物，选用配套的,Ab,。如,Ab-I,鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他,动物，而且,Ab-,必须是羊抗鼠，若,PAP,法,Ab-,必,须来源于鼠，否则不能连接成复合物,若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差,异，在,贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。,选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。,2,Ab,稀释度,（如系购买的药盒有工作液和原液）,（,1,）工作液：无须稀释,（,2,）原液：,应参照其提供的工作液浓度进行预试验,原液的保存（,-20,）冻存,应选最佳稀度冻存。,若工作浓度,大于,1,500,则要先将原液稀释十倍,，而,后分装,10l/,瓶,冻存（,-20,）于,冰箱备用。,（,3,）,Ab,浓度的选择,Ab,浓度不可太高或太低，因为,Ag-Ab