核酸 Nucleic Acid课件

1、第 四 章核酸,Nucleic Acid,核 酸(nucleic acid,是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 2001

2、年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,噬菌体T2结构,DNA,1.制备两份分别由32P和35S标记的噬菌体.（DNA不含S，蛋白衣壳不含P） 2.分别感染细菌（未标记） 3.搅拌、剪切使病毒衣壳离开细菌 4.通过离心分离衣壳和细菌。 结论 DNA是遗传物质,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和S

3、anger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比,上页 下页 章首 节首,第二节 核酸的分类、分布,遗传密码,第三节 核酸的化学组成 The Chemical Component of Nucleic Acid,一、核酸的元素组成,C、H、O、N、P （910,二、组成核酸的基本单位,核苷酸,多核苷酸,核苷酸,A、G,U、C、T,嘌呤碱,嘧啶碱,A （腺嘌呤）、G （鸟嘌呤,U （尿嘧啶）、C （胞嘧啶）、

4、T （胸腺嘧啶,两类 核酸在分子组成上的异同点,命名,核 酸,戊 糖,嘌呤(purine,腺嘌呤(adenine, A,鸟嘌呤(guanine, G,碱 基,嘧啶(pyrimidine,胞嘧啶(cytosine, C,尿嘧啶(uracil, U,胸腺嘧啶(thymine, T,几种稀有核苷,上页 下页 章首 节首,5-甲基胞嘧啶核苷,N6-甲基腺嘌呤核苷,N2-甲基鸟嘌呤核苷,5-羟甲基胞嘧啶核苷,几种稀有核苷,上页 下页 章首 节首,次黄嘌呤核苷,假尿嘧啶核苷,7-甲基鸟嘌呤核苷,4-硫尿嘧啶,核苷（nucleoside,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,上页 下页

5、 章首 节首,嘧啶核苷,嘌呤核苷,嘧啶碱： C1 N1，嘌呤碱： C1 N9。 核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型 碱基平面与核糖平面互相垂直,核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,三、核苷酸的结构,核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,磷酸基团的位置 2，3， 5,5-核糖核苷酸,2-核糖核苷酸,3-核糖核苷酸,2, 3-环核糖 核苷酸,组成核酸的结构单位是5单核苷酸,DNA（dAMP, dTMP, dCMP, dGMP,RNA（AMP、UMP、CMP、GMP,核苷酸衍生物,1.

6、继续磷酸化,核苷5-多磷酸化合物 ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG 在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用,M：Mono单一； D：Di双； T：Tri三,AMP,ADP,ATP,2.环化磷酸化,cAMP,cGMP,环核苷酸 3,5-cAMP， 3,5-cGMP 第二信使，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢,3. 肌苷酸及鸟苷酸(强力味精,4. 辅酶 NAD+、NADP,IMP（次黄嘌呤核苷酸,GMP,第四节 核酸的共价结构,C,G,A,多聚核苷酸的特点,在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为35磷酸二酯键。 C5带有一个自由磷酸基，称为5-磷酸端（常用5-P表示）

7、； C3带有自由的羟基，称为3-羟基端 （常用3-OH表示）。 多聚核苷酸链具有方向性53,表示方法,在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱基的种类和顺序，所以上式可以进一步简化为： 5PAPCPGPCPTPGPTPA 3 或5 ACGCTGTA 3,一、 核酸的水解,核酸的降解：在酸、碱和酶的作用下，发生共价断裂， 糖苷键和磷酸酯键都能被打断。 1. 酸水解 对酸的敏感性： 糖苷键磷酸酯键 嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键,2. 碱水解 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别,DNA抗碱水解 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解,RNA的磷酸酯键易被碱水解

8、，产生核苷酸混合物,碱水解,2-核苷酸3-核苷酸 混合物,返回,核酸酶是指专一水解核酸的酶 依据底物不同分类 DNA酶(DNase) ，脱氧核糖核酸酶，专一降解DNA。 RNA酶 (RNase) ，核糖核酸酶，专一降解RNA。 非特异性核酸酶 ：蛇毒磷酸二酯酶 从3-OH与磷酸间 脾磷酸二酯酶 从5-OH与磷酸间 依据切割部位不同 核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。 核酸外切酶：53或35核酸外切酶,3. 酶水解,二、核酸的一级结构,定义 核酸中核苷酸的排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列,三、信使mRNA的结构与功能,内含子 (intro

9、n,mRNA成熟过程,外显子 (exon,目 录,占总RNA的35,上页 下页 章首 节首,原核生物mRNA特征： 先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列 多顺反子：能为两条以上不同肽链编码的mRNA 真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5ppp5-N-3p）+单顺反子+ “尾巴”（Poly A） 单顺反子：只能为一条肽链编码的mRNA,三、信使mRNA的结构与功能,原核细胞mRNA的结构特点,真核细胞mRNA的结构特点,mRNA结构特点,1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm,2. 大多数真核mRN

10、A的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾,由甲基化酶催化 1.可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。 2. 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成,帽子结构,3.与蛋白质合成的正确起始作用有关,多聚A尾的功能,3-端有一段约20-250核苷酸的polyA。 转录后由poly(A)聚合酶催化加尾 1.PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。 2.polyA与mRNA半寿期有关， PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性,mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列

11、顺序,rRNA的结构,四、核蛋白体RNA的结构与功能,rRNA的功能 rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。 参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所,rRNA的种类（根据沉降系数,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,DNA序列分析 1.双脱氧终止法（酶法测序） 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群,DNA酶法测序,上页 下页 章首 节首,

12、平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，DNA聚合酶，相同的引物以及四种脱氧核苷三磷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示,DNA酶法测序,DNA酶法测序,上页 下页 章首 节首,DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP,2. 化学裂解法 Maxam-Gilbert ， 1977 原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此

13、片段群经侧序胶电泳和放射自显影得到侧序图谱。 32P-GCTACGTA： 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG,DNA序列分析,第五节 核酸的高级结构,一、 DNA的二级结构 双螺旋结构,DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型,double-helical structure,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构,1DNA双螺旋结构模型,返回,DNA双螺旋结构的要

14、点,1)两条反向平行的链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35,磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架,2.结构描述 (1)磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧,2)碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行,3)每圈螺旋10个碱基（实测10.4个） ，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2nm， 大沟：宽1.2nm ，深0.85nm， 小沟 ：宽0.6nm，深0.75nm,3. 每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋

15、旋转一圈）高度为3.4 nm,4.双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。 碱基的相互结合具有严格的配对规律，A-T，G-C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A T间形成两个氢键，G C 间 三个氢键。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等,碱基互补配对,T,A,C,G,1） BDNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA(相对湿度为92%时的DNA钠盐纤维) 右手双螺旋,每圈螺旋10.4个碱基对 螺距：3.4nm （2） A-DNA(相对湿度低于75%) 右手双螺旋，外形粗短。碱基平面倾斜19，螺旋变粗变短，螺距23nm。 RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 （3）Z-D

16、NA 左手螺旋，外形细长。直径1.8nm,螺距4.5nm。每圈螺旋有12个碱基 天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。 盐浓度、离子种类、有机溶剂能引起DNA构象的改变 NaCl,BA,三）DNA双螺旋结构的多样性,2.具5CpGpGpTpAp-3顺序的单链DNA能与下列哪种RNA杂交? A、5-GpCpCpAp-3 B、5-GpCpCpApUp-3 C、5-UpApCpCpGp-3 D、5-TpApCpCpGp-3,3.RNA和DNA彻底水解后的产物 A、核糖相同，部分碱基不同 B、碱基相同，核糖不同 C、碱基不同，核糖不同 D、碱基不同，核糖相同,4.下列关于Z型DNA结构的叙述哪一

17、个是不正确的? A、它是左手螺旋 B、每个螺旋有12个碱基对，每个碱基对上升0.37nm C、DNA的主链取Z字形 D、它是细胞内DNA存在的主要形式,1.有两个DNA样品，分别来自两种未确认的细菌，这两个DNA样品中的A含量为别占它们DNA总碱基的32%和17%。这两个DNA样品的A、G、C、T相对比例是多少？其中哪种DNA是取自温泉(约20-40)环境下的细菌，哪一种DNA是取自嗜热菌(约45-70或更高) ,7ATP分子中各组分的连接方式是： AR-A-P-P-P BA-R-P-P-P CP-A-R-P-P DP-R-A-P-P,8. 根据Watson-Crick模型，求得每一微米DNA

18、双螺旋含核苷酸对的平均数为： A25400 B2540 C29411 D2941 E3505,9. 符合DNA结构的正确描述是(A) 两股螺旋链相同 (B) 两股链平行，走向相同 (C) 每一戊糖上有一个自由羟基 (D) 戊糖平面垂直于螺旋轴(E) 碱基对平面垂直于螺旋轴,5. B型DNA双螺旋的螺距为_，每匝螺旋有_对碱基，每对碱基的转角是_。 6. 常见的环化核苷酸有_和_。其作用是_，他们核糖上的_位与_位-OH磷酸环化,DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象 超螺旋是DNA三级结构的主要形式,2、DNA的三级结构,正超螺旋DNA是由于两条链的缠绕过度引起，即“过旋”时,正超螺旋

19、,负超螺旋,负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，即“欠旋”。很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等,连环数（linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 缠绕数（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示 超螺旋数（ writhing number , W,L=T+W,DNA的拓扑学特性,3.DNA与蛋白质复合物的结构,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome,核小体,组蛋白核心(八聚体):H2A, H2B, H3, H4各2个分子 DNA以左

20、手螺旋在组蛋白核心上缠绕1.8圈,共146bp; 核小体由连接DNA （54bp）相连; H1结合在连接DNA上,核小体定义：是真核生物染色质的基本结构单位,是由DNA绕组蛋白核心盘旋所形成的串珠状结构,DNA的存在形式,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA(2nm,核小体链(11nm，每个核小体200bp,纤丝(30nm，每圈6个核小体,突环(150nm，每个突环大约75000bp,玫瑰花结(300nm ，6个突环,螺旋圈(700nm，每圈30个玫瑰花,染色体(1400nm,每个染色体含10个玫瑰花,返回,一、结构特点 碱基组成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有碱基较多，稳定性

21、较差，易水解 多为单链结构，少数局部形成螺旋 分子较小（几十到几千个核苷酸） 分类 mRNA（hnRNA 核不均一RNA） tRNA rRNA （snRNA/snoRNA） 少数RNA病毒,二、RNA的高级结构,tRNA的一级结构特点 通常由7393个核苷酸组成 含 10-15% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G 存在恒定核苷酸,1、转运RNA的结构,氨基酸臂,可变环,DHU环,反密码环,TC环,tRNA的二级结构三叶草形,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,二氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,次黄嘌呤,假尿嘧啶核苷,1)氨基酸臂3-末端的最后3个核苷酸残基都

22、是CCA，氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。(2)反密码环与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码子,3)二氢尿嘧啶环 该区含有二氢尿嘧啶。 (4) TC环 该区与二氢尿嘧啶区相对， 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tRNA在此环中都含有TC 。 (5)可变环 位于反密码区与TC区之间，不同的tRNA该区变化较大,tRNA的三级结构 倒L形,tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译,RNA的种类、分布、功

23、能,三. DNA与基因组,基因（gene）：能编码有功能的蛋白质多肽链或合成RNA必需的全部核酸序列。生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位,基因组（genome）：某生物体所含全部遗传物质的总和。 包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA,原核生物基因组特点 1.大部分为编码蛋白质的结构基因，重复序列少，调控序列所占比例少 2.多为连续的、无内含子、功能相关的基因串在一起，转录于同一mRNA上 3. 有重叠基因存在,真核生物基因组特点 1.有重复序列 单拷贝序列 : 占一半以上，编码蛋白质的结构基因 中度重复序列：占30-40%，序列长达几百个bp，重复次数达1000次

24、以上。 高度重复序列：占10%，多位小于10bp的短序列，可重复几百万次 2.断裂基因,内含子 (intron,mRNA成熟过程,外显子 (exon,目 录,核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第 六 节,目 录,一、一般物理性质,DNA和RNA微溶于水，但它们的钠盐易溶于水，均不溶于乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂。 天然DNA分子长度可达几厘米，而分子直径只有20埃米。这种细丝状的双螺旋结构赋于DNA 一系列显著的物理化学特性。 磷酸、碱基的解离(两性解离) 核苷酸pI RNA pI=2-2.5 D

25、NA pI=4-4.5 生理状态下，磷酸基团全部解离，呈多阴离子状态。 DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl，但溶于高浓度NaCl(12mol/L)溶液，RNA易溶于0.14mol/LNaCl,二、紫外吸收,由于核酸组分嘌呤和嘧啶具有强烈的紫外吸收性能，所以核酸也有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260nm处。这可作为核酸及其组份定性和定量测定的依据,二、紫外吸收,1.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 2. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（

26、或RNA） 20g/ml寡核苷酸,OD260的应用,目 录,定义：核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性的因素 热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛,1 核酸的变性,三、 核酸的变性、复性与杂交,变性后的理化性质 ： 1.260nm吸收值升高。 利用紫外吸收的变化， 可以检测核酸变性的情况。 例如:天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增加2540%.而RNA变性后，约增加1.1%。这种现象称为增色效应. 2.粘度降低，浮力密度升高。 3.二级结构改变，部分失活,1） 熔解温度（Tm）： DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度，也称DNA变性温度 浓度50ug/mL时，双链DNA