DNA复制、引物、酶及蛋白质

1、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质、DNA复制过程一、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质DNA复制起始一共涉及到 DnaA（复制起始因子，识别 OriC序列）、 DnaB（DNA解链酶）、DnaC（召唤DnaB到复制叉）、HU（结合DNA使之 弯曲）、引物合成酶、单链 DNA结合蛋白、RNA聚合酶、DNA旋转酶、 Dam甲基化酶，一共是9种重要的酶或蛋白质，其中 DnaA DnaB引物 合成酶、单链DNA结合蛋白、Dam甲基化酶非常重要。DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物， 再由聚合酶从RNA引物3端开始合成新的DNA链。对于前导链来说，

2、 这一引发过程比较简单，只要有一段 RNA引物，DNA聚合酶就能以此为 起点，一直合成下去。对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白 质和酶参与。 后随链的引发过程由引发体来完成。 引发体由 6种蛋白质 构成，预引体或引体前体把这 6 种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物 过程酶进一步组装形成引发体。 引发体似火车头一样在后随链分叉的方 向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶III 作用合成DNA直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。 由RNAB H降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐，再由DNA连 接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA.。1.

3、解链酶 （helicase,unwinding enzyme）复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程。 在DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，在起始点处解开双链，反 应是在解链酶的催化下进行的。解链酶有 ATP酶活性的酶，两种活性相 互偶联，通过水解ATP提供解链的能量。解链酶的作用就是打开 DNA双 链之间的氢键。解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA勺存在。如果双链DNA中有 单链末端或切口，则DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。复制时，大部分 DNA解旋酶可沿滞后模板的53 方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶(Rep蛋白)是沿着3

4、5方向移动的。故推测Rep蛋白和特定DNAS链酶是分别在DNA 的两条母链上协同作用以解开双链 DNA。大肠杆菌中DnaB蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板DNA结合， 沿5一3 方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板 DNA结合 沿3一5 方向移动。2. 单链结合蛋白 (single strand binding proteins,SSBP)ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第 1个ssbDNA蛋白结合 到DNA上去能力为1,第2个的结合能力可高达103;真核生物细胞中 的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则

5、不表现上述效应。ssbDNA蛋白的作 用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构, 它以四聚体 的形式存在于复制叉处,待单链复制后才脱下来,重新循环。所以, ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。ssbDNA蛋白稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。它与解开的单链DNA吉合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBF可以重复利用(图)SSBP与DNA单链结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为四聚体，对单链 DNA

6、有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲和力。它们与 DNA吉合时有协同作用。图大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图3、DNA旋转酶(DNA gyrase )是一个由两个 GraA和两个GraB亚基构成的四聚体蛋白，DNA旋转酶以其可以利用 ATP结合和水解的能量来介导 负超螺旋到松弛的共价闭合 DNA而闻名于所有拓扑异构酶。它是DNA拓扑异构酶U中的一种亚类，其主要功能为引入负超螺旋，在DNA复制中起十分重要的作用。迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA旋转酶。作用机理：DNA复制时解链产生正螺旋，阻碍复制体的前进，DNA旋转酶通过引起瞬间 DNA双链的断裂和重新连接，以改变 DNA勺拓

7、扑状态，引入负超螺旋。4. 引发体的形成：DNAM制起始的关健步骤是前导链 DNA勺合成，一旦前导链DNA勺 聚合作用开始，随从链DNA勺合成也随着开始。由于前导链的合成是连 续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的， 所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由 Dna B. Dna C 和单链 结合蛋白组成。(1) 引物酶 (primase)它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA勺合成。这种短RNA 片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个 磷酸二酯键的位置。催化RNA引物

8、合成的酶叫引发酶(primerase )。引发酶识别 DNA 单链模板特异序列， 以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸， 产生 3 -0H,为DNA聚合酶起始磷酸二酯键提供条件。引物与典型的RNA不同，他们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。实验表明，在细菌中，前导链的引物和滞后链中前体片断的引物在合成 时需要不同的条件。 滞后链前体片断引物的合成是由引发酶催化的，而 引发酶对利福平( rifampicin )不敏感，因此不受利福平抑制；前导链 引物的合成是由RNA聚合酶催化的，而RNA聚合酶对利福平十分敏感， 所以受利福平强烈抑制。(2) 引发体 (primosome)高度解链的

9、模板DNAf多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在 DNA随从链上开始，它连续 地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成 RNA引 I物， 在引物RNA的3桹H末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续 合成的开始。5、DNA聚合酶1) DNA聚合酶 IDNA聚合酶I最初由Kornberg于1955年在大肠杆菌中发现的，纯化的酶是一条相对分子量为109KD的多肽链。用枯草杆菌蛋白酶处理可以将 DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。 较大的C末端片断分子量为68KD叫klenow片断，常用做体外合成DNA 的工具酶；具有5 3的聚合酶活性，可

10、以将脱氧核苷三磷酸加到DNA链的3 -OH上，形成3, 5-磷酸二酯键，这个活性需要 DNA模 板和引物的存在。 klenow 片断还具有 35的外切酶活性，可以从 3端将DNA链水解。当正确的核苷三磷酸进入正在合成的链的末端， 酶就向前移动，一旦发生错误，酶就退回，将错误的碱基切除，这是一 种校对( proofreading )功能。较小的N末端片断分子量为35 KD,具有5 3的外切酶活性，在体 内功能是切除小的DNA片断，包括切除RNA引物。尽管DNA聚合酶I活性很高，但它们的主要功能是用于修复体内DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。DNA聚合酶I

11、的5 3核酸外切酶活性从5端切除DNA受损伤的部 位DNA聚合酶I的5 3 聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3 端延伸，这称为切口平移( nick translation )。在DNA复制中，RNA引物的切除实际上就是切口平移；DNA的损伤修复 中也存在切口平移。 在体外，可以用切口平移来制备高放射性活性的 DNA 探针。2) DNA聚合酶川DNA聚合酶川全酶以异源复合体发挥功能。a亚基、亚基和B亚基相 连组成核心酶(core enzym,每种亚基两个，形成两个催化合成 DNA的活性中心。a亚基具有 5一 3的聚合酶活性，并具有 53的外切酶活性；亚基具有3 宀5的外切酶活性，这对校正功能

12、十分重 要。核心酶在t亚基存在下，形成二聚体。其他亚基的添加促进二聚化 和增强了酶活性（T亚基起着促使核心酶二聚化的作用）。DNA聚合酶川具有持续合成能力，卩亚基在二聚体形成中发挥重要的作用。卩亚基的功能犹如夹子、两个卩亚基夹住DNA分子并可以向前滑动，使 聚合酶在完成复制前不再脱离 DNA从而提高了酶的持续合成能力（通 过它形成一个环使DNA聚合酶川的核心酶附着在 DNA模板上，并可以沿 单链DNA滑动而使DNA勺复制过程程序化）。B亚基的定位能防止核心 酶在DNA复制过程中从模板上掉下来， 如果没有B亚基，核心酶只能合 成大约 20 个核苷酸就要脱离模板。除了 B亚基以外，y亚基是一种依赖

13、于 DNA的 ATP酶，两个y亚基与另4个亚基（3亚基、3亚基、x亚基、亚基）构成Y复合物，其主 要功能时帮助B亚基夹住 DNA故称夹子装置器（clamp loader 亚基在DNA上定位和解离都需要y复合物介导。 完整全酶为不对称二聚 体结构。当聚合酶遇到逆向模板上前面合成的冈崎片断时，y复合物的存在允许B亚基从模板上解离。这样当核心酶合成了冈崎片断，将从后 滞链的全酶中释放出来，与下一个由DNA引发酶提供的模板引物的起始 前复合物结合。在半不连续复制过程重，同一个DNA聚合酶川分子可以同时合成前导链 和滞后链。更确切地讲，在前导链和滞后链的生长点，核苷酸的增加同 时进行。如前所述，DNA聚

14、合酶川有两个DNA合成催化中心，很可能前 导链和滞后链各利用一个催化中心合成 DNA滞后链的模板链围绕一个 催化中心折叠成环状结构，使滞后链的方向颠倒 （ 生化方向不变 ） 。6、DNA连接酶DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的 3 -OH与5 - P酰基形成磷 酸酯键。酶的活化? NAD+或 ATP中的腺苷酰基（AMP与酶活性中心的赖氨酸残 基的 -NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶 -AMP;腺苷酰化DNA?酶-AMP将腺苷酰基（AMP转移给DNA切口处的5磷 酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成 AMP-P-DNA亲核攻击完成DNA连接？通过相邻DNA的3 -OH对活化的P原子进行 亲

15、核攻击，生成 3， 5 - 磷酸二酯键，同时释放出 AMP。二、DNA复制过程真核、原核的复制大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNAM制的终止三个阶段。起始：DNAS旋酶在局部展开双螺旋结构的 DNA分子为单链，引物酶辨 认起始位点，以解开的一段 DNA为模板，按照5到3方向合成RNA短 链。形成RNA引物。DNA片段的生成：在引物提供了 3-OH末端的基础上，DNA聚合酶催化 DNA的两条链同时进行复制过程，由于复制过程只能由5-3方向合成， 因此一条链能够连续合成，另一条链分段合成，其中每一段短链成为冈 崎片段（ Okazaki fragments ）（ 由日本冈崎夫妇发现并命名

16、） 。RNA引物的水解：当DNA合成一定长度后，DNA聚合酶水解RNA引物,补填缺口。DNA连接酶将DNA片段连接起来，形成完整的 DNA分子。 最后DNA新合成的片段在旋转酶的帮助下重新形成螺旋状。（一）DNA复制的引发复制的引发（Priming）阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激 活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷 酸加到引物RNA的 3-0H末端。复制引发的关键步骤就是前导链 DNA勺合成，一旦前导链DNA勺聚 合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合 之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶（不是引物酶）沿滞后链模板转录 一

17、短的RNA分子。在有些DNA复制中，（如质粒ColE），该RNA分子经过 加式成为DNA复制的引物。但是，在大部分 DNA复制中，该RNA分子没 有引物作用。它的作用似乎只是分开两条 DNA链，暴露出某些特定序列 以便引发体与之结合，在前导链模板 DNA上开始合成RNA引物，这个过 程称为转录激活 （transcriptional activation） ，在前导链的复制引发 过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。这两种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体 功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与 DNA复制起点结合后能促进 DNA聚 合酶川复合体的七

18、种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。DNAS制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链 DNA解开，通过转录激 活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子 X（n 蛋白） ，复制因子 Y（n 蛋白） ， n 蛋白， i 蛋白， dnaB 蛋白和 dnaC 蛋白等 6 种蛋白质组成的引发前体 （preprimosome）,在单链DNA结合蛋白的作用下与单链 DNA结合生成中 间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶 （primase） 组装 成引发体（primosome）。引发体可以在单链 DNA上移动，在dnaB亚基的 作

19、用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段 RNA引物，然后，弓I发体在滞后链上沿5 f 3方向不停的移动（这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后 ），在一定距离上反复 合成RNA引物供DNA聚合酶川合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因 子的功能尚不清楚。 但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后 链上移动，识别合适的引物合成位置， 并将核苷酸在引发位置上聚合成 RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向 相反，所以在滞后链上所合成的 RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷 酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明

20、引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置（序列）上才能合成RNA弓 物。为什么需要有RNA引物来引发DNAM制呢？这可能尽量减少DNA复 制起始处的突变有关。DNAM制开始处的几个核苷酸最容易出现差错， 因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被 DNA聚合酶I切除，提高了 DNAM制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶川催化将第一个脱 氧核苷酸按碱基互补原则加在 RNA弓物3-OH端而进入DNA链的延伸阶(二)DNA链的延伸以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3 5走向，在其上DNA能以5 3方向连续合成，称为前导链(leadi ng stra nd); 另一条模板链为53走向，

21、在其上DNA也是53方向合 成，但与复制叉移动的方向正好相反， 故随着复制叉的移动形成许多不 连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(lagging strand)。两条单链DNA复制的引发过程有所差异，但是不论 是前导链还是后随链，都需要一段 RNA引物用于开始子链DNA的合成。 因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按53持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长 约 23kb 的冈崎片段。DNA新生链的合成由DNA聚合酶川所催化，然而，DNA必须由螺旋 酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题 : 由于DNA的解

22、链，在DNA双链区势必产生正超螺旋， 在环状DNA中更为 明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种 机制可以防止这种现象发生 :1DNA 在生物细胞中本身就是超螺旋，当 DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和；2DNA 拓扑异构酶I要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA 拓扑异构酶U (旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入 双链DNA这两种机制保证了无论是环状 DNA还是开环DNA勺复制顺利的解链，再由DNA聚合酶川合成新的DNA链。前已述及DNA生长链的

23、延 伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由7种蛋白质（多肽）组成的聚合体， 称为全酶。全酶中所有亚基对完成 DNA复制都是必需的a亚基具有聚 合功能和5 -3外切酶活性，亚基具有 3 -5外切酶活性。另外， 全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶川催化第一个脱氧核糖核苷酸连接 在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶川在同一时间分别进行复制 DNA前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕 DNA聚合酶川全酶，并通过 DNA聚合酶川，然后再折向与未解链的双链 DNA在同一方向上，则滞后 链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。这样，当DNA聚合酶川沿着滞后链

24、模板移动时，由特异的引物酶催 化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶川所延伸。当合成的DNA链到达 前一次合成的冈崎片段的位置时， 滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从 DNA聚合酶川上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了 又一段单链的滞后链模板，它重新环绕 DNA聚合酶川全酶，并通过 DNA 聚合酶川开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多 （最后只有一个冈崎片段的长度 ）。而且，这样引 发体在DNA链上和DNA聚合酶川以同一速度移动。按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶 川全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体

25、，称为DNA复制体（replisome）。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时 便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是 DNA聚合酶川的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶I通过其5 -3外切酶活性切除冈崎片段上的 RNA引物，同时，利 用后一个冈崎片段作为引物由 5 -3合成DNA最后两个冈崎片段由 DNA连接酶将其接起来，形成完整的 DNA带后链。实验证明DNA的复制是由一个固定的起始点开始的。一般把生物体 的单个复制单位称为复制子。一个复制子只含一个复制起点。一般说， 细菌，病毒即线粒体DNA分子均作为单个复制子完成其复制，真核生物

26、基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制， 即它们的基因组包括 多个复制子。多方面的实验结果表明，大多数生物内DNA勺复制都是从 固定的起始点以双向等速方式进行的。 复制叉以DNA分子上某一特定顺 序为起始点，向两个方向等速生长前进。（三）DNA复制的终止过去认为，DNA-旦复制开始，就会将该 DNA分子全部复制完毕， 才终止其DNA复制。但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位 点，DNAM制将在复制终止位点处终止， 并不一定等全部DNA合成完毕。 但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少在NDA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性 DNA分子两端是如何完成其复制的？已知DNA 复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由 DNA聚合I所填充。但是，在线性分子的两端以5 -3为模板的滞后链 的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被 DNA聚合酶所填充的。在研究T7DN