临床基因扩增检验实验室工作规范

1、临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检 验质量，特制定本规范。一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号文）附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。为避免污染，必须严 格遵循临床基因扩增检验实验室设置标准设置临床基因扩增检验实验室。临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同 的工作区域间设备物品发生混淆。 进入

2、各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区， 避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩 增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。（一）试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在

3、打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区 内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备 用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试 剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查， 评价结果必须 有书面报告。对于热启动技术（在第一个高温变性步骤后加入酶），聚合酶也可不包含在主 反应

4、混合液中。在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性 帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化 学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对 去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯 （254nm 波长 ），在工作完成后调至实验台 上 6090cm 内照射。由于扩增产物仅几百 bp ，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片 段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。（

5、二）标本制备区 下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸 （RNA 、DNA） 提取、贮存及其加入至扩增反应 管和测定 RNA 时 cDNA 的合成。要正确使用加样器。 由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染， 所以应避免在本区内 不必要的走动。 可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免 样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危 险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒 （例如含次氯酸钠溶液 ）容器内。实验室桌椅表面每次 工作后都要清洁，实验材料 （原始血标本、血清标本、提取中的标本与

6、试剂的混合液等 ） 如出 现外溅，则必须分别处理并作出记录。对实验台适当的紫外照射 （254nm 波长，与工作台面近距离 ）适合于灭活去污染。可移动紫外 线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。样本处理对核酸扩增有很大影响， 必须使用有效的核酸提取方法， 可在开展临床标本检测前 对提取方法进行评价。用于 RNA 扩增检测的样本制备好以后，应立即进行 cDNA 合成，因为 cDNA 链较 RNA 稳 定，保存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。cDNA 合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条 件下具有逆转录活性的热稳定的

7、 DNA 聚合酶进行逆转录，其较 cDNA 合成后再开盖以调节 缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。待测 RNA 的 cDNA 拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行 PCR 扩增。（三）扩增区下述工作在本区内进行： DNA 或 cDNA 扩增。此外，已制备的 DNA 模板和合成的 cDNA（ 来 自样本制备区 ）的加入和主反应混合液 （来自试剂贮存和制备区 ）制备成反应混合液等也可在 本区内进行。在巢式 PCR 测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有 较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。不能从本区再进入任何 上游 区域，可降低本区的气压以避免气溶

8、胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打 开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出， 尤其是在巢式扩增步骤之间。 一个简单的方 法是在打开反应管前快速离心数秒。可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于 用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但 必须注意的是， 矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。 用过的加样器必须注意清洁消 毒。完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相 同。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。（四）扩增产物分析区下述操作在本区内进行：扩增

9、片段的测定。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法（同位素标记或非同位素标记 ）、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Southern 转移、核酸测序方法等。目 前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即 PCR-ELIS A 方法，也有膜上探针杂交方法。本区是最主要的扩增产物污染来源， 因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物 带出。在使用 PCR-ELISA 方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至 1 mol/L HC1 中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离 PCR 实验室的地方弃掉。用过的吸 头也必须放至 1

10、mol/L HCl 中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、 丙烯酰胺、 甲醛或同位素 等，故应注意实验人员的安全防护。本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下（如安装排风扇）可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。二、临床基因扩增检验实验室质量保证临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段， 即测定分析前的标 本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。（一）标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括 EDTA 或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、

11、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用 非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物 的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理， 因为玻璃器皿常含有不易失活的 RNA 酶。最好是热灭菌， 2 50 C烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。 EDTA 和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。 不能使用肝素抗凝， 因为肝素是 Taq 酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快 （3小时以内）分 离血浆，以

12、避免 RNA 的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在 1 小时内分离血清。（二）标本的稳定化处理用于 DNA 扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验 室。由于 RNA 易受 RNA 酶的降解，因此用于 RNA 测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流 行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐 （Guanidine thiocyanate,GITC） 可使 DNA 酶和 RNA 酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按 1:4 的比例加至含有 5mol/ L GITC 的试管中，从而使血清 （ 浆 ）中的 RNA 酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一

13、 般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使 用相应的逆转录 PCR 测定方法来评价。（三）标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。 经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。 如 用于 DNA 扩增检测的 EDTA 抗凝全血标本及用于 RNA 扩增检测的经 GITC 稳定化处理的 标本。通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于 RNA 检测的标本，如果未经 稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。（四）标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70 C下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris-1 mmol

14、/L EDTA缓冲液（pH 7.5-8.0）中4 C保存。用于RNA测定的已纯 化核酸样本应在缓冲液中-80 C或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20 C即可。用 GITC 处理的 RNA 标本在室温可保存 7 天。（五）标本的处理 （核酸提取）标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤， 在使用商品核酸提取试剂提取 临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质 量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身 （如血红素及其前体或降 解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂 （如酚、氯仿等），这些物质对其后的 Taq 酶扩增反 应

15、步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液 化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸 为 RNA 时，逆转录 PCR 测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸 提取试剂的 RNA 酶的污染。 对于前者，要核查测定分析前的步骤， 如果发现有 RNA 降解的 证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后 者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增 1 、靶 RNA 的逆转录cDNA 合成为逆转录 PCR 中的第一个酶反应步骤，所产生的 cD

16、NA 为靶 RNA 的反向互补链， 为后面扩增的模板。下述因素通常影响 cDNA 合成的效率： （1）逆转录效率的降低或完全缺 乏。其可能的原因有逆转录酶质量不高、 试剂降解变质或加样错误等； （2） 用于逆转录的标本 中存在逆转录或 Taq 酶的抑制物 （如酚、氯仿、血红素等 ）；（3）RNA 酶的存在导致 RNA 的降 解。2、核酸的扩增 有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、 Taq 酶失活、退火温度不对、 Mg+ 浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的 均一性极为重要， 必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查，

17、以 避免假阴性结果。（七）污染在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染 （产物污染 ）；天然基因组 DNA 的污染、试剂污染 （贮存液或工作液 ）以及标本间交叉污染 （如气溶胶从一个阳性标本扩散到原 本阴性的标本 ）。临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。由于一旦发生污染后， 再围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐， 所以防止污染重 在预防。但如果发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为止，并且实验结果必须 作废。1、测定分析前的污染源测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。2、测定分析阶段的污染源通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对

18、样本的污染。 反应混合液的任何成分及核酸的制 备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂（例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油 ）、商品酶制剂、消耗品 （如反应管，吸头 ）和实验设备 （如加 样器、离心机 ）等。在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而 在产物分析区，当吸取扩增产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定标准操作程 序（SOP），并严格执行。3、污染的避免要避免污染， 首先应是预防而不是排除污染， 前面所述对工作区的严格划分的目的即是为了 预防污染。为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如

19、在扩增反应中用 dUTP 取代部分 dTTP ，使得产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加入尿 嘧啶糖苷酶 （UNG） ，可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对以后要进行的扩增测定 的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射， 通过异补骨脂素光化学产生 DNA 加合物， 由于 DNA 加合物对扩增没有反应但又不妨碍 PCR 后杂交过程，所以这种方法也能防止污染。上述防污染方法只在一定程度上有效， 所以不能用其来替代严格的实验室设置和管理， 尤其 是这些方法不能防止外来非扩增的天然 DNA 的污染。4、去除污染的措施工作完后必须定期对实验室采取有效的去污染措施，结合各种不同

20、的方法可达到最佳效果。 去污染措施包括但不仅限下面几种： （1）用 10%（v/v） 次氯酸钠清洁表面； （2）试验后长时间的 紫外照射实验操作台面和其他表面； （3） 实验设备如加样器的高压消毒。（八）扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度 法定量等，但临床 PCR 检验项目基本上都使用探针杂交方法。杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或 洗涤方法不合适等。最常使用的基因探针有： DNA 片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义 RNA 探针。探针的 标记物常用的有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。

21、在扩增后的杂交检测中 , 应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或 离子强度太高都会降低杂交的严格性，还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高 温度和 /或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂的离子强度是避 免假阳性和假阴性结果的先决条件。要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。（九）质量控制质量控制包括两个方面，即室内质量控制 （以下简称质控 ）和室间质量评价。1、室内质量控制必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准 确性和重复性。由于核酸扩增测定的高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分 析中的每

22、一步都要求有质控措施。（1）标本制备：常用琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA 提取效果，以判断所提取的 DNA 是否发生降解。 用常规的 手工提取方法制备的 DNA 的平均长度一般为 100kb ，用适合 PCR 的 DNA 提取试剂盒制备 的DNA的长度平均范围为30-40kb。明显出现降解的DNA（在1和10kb的低分子量范围内） 在经琼脂糖凝胶电泳分离和用溴化乙锭染色后也可见强的荧光信号。 用对甲基化不敏感的限 制性内切酶（如EcoRI）消化DNA，然后电泳分离，能够对酶活性的抑制剂进行质控 （在抑制 剂存在的情况下，高分子量的片段不被酶切 ）。潜在的抑制剂的存在通常用 260nm 和 280

23、n m 的分光光度测定来估计，质量好的 DNA 提取物， A260/A280 比值应该在 1.752.0 之间; 否则,残留的蛋白或酚可能会很高。仅用光度计比色方法不能对DNA 的完整性下结论。最快的对总 RNA 提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电泳 ,这一点跟 DNA 分离相同。但如果对结果有疑问 ,就应该在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测 RNA 的完 整性。在理想情况下 ,三种主要的核糖体 RNA(28S 、18S 和 5S) 在凝胶上出现的带相对较窄。 如发生 RNA 的降解，则出现大量低分子量带或出现带的消失。 测定核糖体 RNA 带的密度指 数可作为对 RNA 制备

24、的质量评价的实验室内的标准；对向低分子量拖尾的、不对称性的峰 的评估也是 RNA 完整性的合适的指标。 另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在 RNA 的制备中被 DNA 污染的程度。由于这些原因，单独的光度计比色方法也不能对 RNA 的完整性下结论。对于血清(浆)中病毒的测定，则要评价标本出现溶血、脂血和黄胆情况下标本处理方法对 扩增检测的影响，避免由于标本处理方法的不当而出现假阴性结果。此外，还可采用已知浓 度标本评价核酸提取方法的效果。(2) 逆转录和扩增：本部份包括阳性质控和阴性质控。 对逆转录和核酸扩增的质控既可使用内标质控方法也可采用外标质控方法。逆转录-扩增检测的内标通常为在整个细胞周期中均匀表达的 mRNA，如HLA、B肌动蛋白和组蛋白H3.3 的 mRNA 或 14S rRNA 等。此外，也可在标本制备时将外来内标加入到样本中共同提取、 逆转录及扩增。当标本中存在逆转录抑制物，或核酸提取中发生 RNA 降解，或逆转录酶失 活，内标即会表现为阴性结果。对于 DNA 测定内标可使用对有机体存活所必须的靶基因， 如维生素 D 血浆结合蛋白的基因。 对于病原体的基因检测， 内标多采用人工制备的竞争性