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文档简介

1、 料推荐外周血的 NK细胞分离培养1. 样本采集常规操作采集患者外周血，避免样本污染。2. 细胞分离超净工作台中，分装血样于 50mL离心管中，取全血样 1mL计数（ 3mL全血留样）。2000rpm离心 10min，取上层血浆于 50mL离心管（ 1.5mL 未灭活血浆留样）。56灭活 30min，3000rpm 离心 10min，去沉淀后 4保存上清。生理盐水 1:1 稀释混匀血细胞，缓慢加到装有Ficill的离心管内（界面清晰，血样： Ficoll不超过 2:1 ），1600rpm离心 20min。吸弃上清，吸取白膜层到离心管，加生理盐水至45mL，混匀后 1500rpm 离心 10mi

2、n。吸弃上清，生理盐水重悬后合并一管，加生理盐水至 45mL。混匀，取样计数计算细胞总量， 1800rpm离心 10min。参照试剂盒说明书配置培养液、滋养细胞液。3. 细胞培养（山东齐鲁细胞治疗NK细胞培养试剂盒）0d，T75 培养瓶接种：30mL细胞悬液 +NK-1试剂 2 +5%自体血浆，37，5.0%CO2培养箱培养。（接种密度 1.0-1.5*10 6/mL）3d，离心换液： T75 培养瓶中细胞转移至 50ml 离心管 1600 rpm/min 升 6 降 4 离心 10min 去除上清。细胞沉淀 +NK细胞培养液（ 30mL）+5%自体血浆于新 T75 培养瓶。5d，转移到 T1

3、75 培养瓶，细胞状态好，加培养液到50mL（ 5%自体血浆）。6d，观察细胞，细胞状态好，加培养液到120mL（5%自体血浆）。7d，观察细胞长势，装袋并添加 1 支 NK-2 试剂 2 ，加培养液到 220mL（1%自体血浆），菌检。8d，加培养液到 500mL（1%自体血浆）。9d，加培养液到 1000mL（ 1%自体血浆）。10d，加培养液到 1400mL（1%自体血浆）。11d，加培养液到 1600mL（1%自体血浆）。12d，加培养液到 1800mL（1%自体血浆）。13/15d ，根据细胞长势及临床安排收获细胞。计数计活及流式检测。1:NK 细胞培养液： 1 支 D 试剂、 1 支 E 试剂溶解到 1 瓶 C试剂中。2:NK-1 、NK-2 试剂为滋养细胞，须严格按照常规细胞的保存及复苏标准操作，使用前需离心去除上清才能共培养。1 料推荐预实验数据：第 8 天 第 9 天 第 10 天 第 11 天 第 12 天 第 13 天 第 14 天 第 15 天

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