实验一 MS培养基配制和灭菌

1、.实验一 MS培养基配制和灭菌一目的和要求： 1. 学会MS培养基的制作方法;2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。二、仪器与试剂 1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等2. 试剂：MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH 和 1N HCl 三、方法步骤（一）配方设计: 以MS为基本培养基（mg/L）No.6-BANAAIBACK0010.50.121.00.132.00.241.00.252.00.2（二） 配制培养基 (1) 溶化琼脂：量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。(2)

2、 各种母液的吸取：Macro-e 50ml Micro-e 1ml 有机成分 1ml Fe盐 5ml 肌醇 10ml加在一起，倒入烧杯（1L)（3）加入糖:称取 30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的 300ml 蒸馏水中。（4）根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。（5）定容:加蒸馏水（用量杯）。（6）调节pH至5.8，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。（7）分装:3040 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。（8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。（三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为0.

3、120.15MPa,温度为120126，保持1520 min。具体操作步骤： 1. 加水； 2. 把包扎好的培养基装入高压锅； 3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀； 4. 加热；5. 排除冷空气； 6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到 1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在 1Kg 压力(121)下灭菌 1520 分钟即可，但要注意保持稳定压力。 7. 灭菌时间达到 20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。四.作业 1. 总结配制培养基的注意事项。2. 制作培养基前为何要提前配制母

4、液?实验二 短柄五加无性系建立一目的和要求： 1. 学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作;2. 掌握无菌操作技术。二、材料、仪器与试剂 1.材料：短柄五加休眠枝 短柄五加( Eleutherococcus brachypus Harms. ) 为五加科五加属灌木，在我国的分布范围极其狭窄，主要分布于西北黄土高原，逐渐被认为是濒危植物。其茎具有较高的药用价值，有治疗神经衰弱、妇女更年期综合症、继发性高血压、白细胞减少等功效。 2.仪器：超净工作台、灭菌锅、弯头剪、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿等 3.试剂：配制好的 MS培养基各种母液、1mol/L的NaOH、1mol/LHCL、0.1%的

5、升汞、70%的乙醇。 三、方法步骤(一) 无菌操作 准备阶段接种室：1、紫外灯提前照20-30min。 2、70%乙醇或新洁尔喷雾消毒。操作人员：1、穿专用实验服，戴口罩。 2、剪短指甲，流水洗手三次。 操作阶段1、 清理工作台面，70%乙醇擦三次。2、 70%乙醇擦手三次。 3、避免说话和来回走动 (二) 无性系建立1. 配制启动培养基CK MS MS+6-BA 0. 5 mg/L + NAA0.1mg/L MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA0.1mg/L MS+6-BA 2. 0 mg/L + NAA0.2mg/L MS+6-BA 1. 0 mg/L + IBA0.2mg/L M

6、S+6-BA 2. 0 mg/L + IBA0.2mg/L2. 材料的选择：选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。 3. 培养步骤： （1）外植体消毒：去杂流水水洗12h70%乙醇（8-10s）无菌水洗3-5次0.1%HgCl2（10min）无菌水水洗5次 （2）接种： 用剪刀将灭菌后的枝条剪成 长约11.5 cm的单芽茎段。将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，每瓶只接一个。对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。 （3）培养：培养物置于 25 左右的培养室中，每天光照 12 小时，光照度为 850-1200lx。 （4）观察：定期观察培养物的生长情况，及时将污染材料取出。四、 作业1、总结本实验外植体的消毒过程及关键步骤。2、进行试验结果的观测、比较和记录，并通过分析筛选出月季无性系建立的