实验2柱离心法纯化质粒DNA

1、实验二 柱离心法纯化质粒DNA 南京大学 生命科学院 一、实验目的 1、学习和掌握碱裂解法快速提取质粒DNA的原理和方法 2、学习如何用琼脂糖凝胶电泳法鉴定质粒DNA的纯度 3、学习柱离心法纯化质粒DNA的方法 4、学习有关琼脂糖凝胶电泳的技术 二、实验原理 1、碱裂解的原理 细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，使细胞壁破裂，通过控制菌悬液和碱性SDS溶液的比例，使菌液的pH为12.6，在此pH条件下，染色体DNA变性，而质粒DNA保持原构型。加入高浓度的乙酸钠乙酸缓冲液中和溶菌液后，变性的染色体DNA形成絮状物与SDS蛋白质复合物一起沉淀下来，离心去除后，即可从上清中回收质粒DNA。

2、 2、离心柱 特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。 三、实验仪器和试剂 1、仪器 1）台式高速离心机 2）漩涡振荡器 3）本次实验的试剂盒（北京道普生物技术公司生产） 4）塑料离心管 1.5ml3 5）冰槽1 6）微量加样器10l、100l、1000l各一支 7）电泳仪 8）电泳槽 2、试剂 1）大肠杆菌培养液 2）细胞悬浮液（RS） 1 3）裂解液（LS） 4）中和液（NS） 5）DNA结合液（BS） 6）清洗液（WS） 7）TE buffer 四、操作步骤 1. 取液体培养液3ml（ 1.5mlX2)于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上

3、清液，加入100?l细胞悬浮液（RS）（等同于溶液I），充分混匀;置冰上; 2. 加入150?l 裂解液（LS）（等同于溶液II），加盖颠倒6次使之混匀，冰上放置12min; 3. 加入150 ? l 中和液（NS）（等同于溶液III），加盖后颠倒6次混匀，冰上放置5min; 4. 用台式高速离心机，12000r/min离心10min; 5. 吸附柱中加入420ul DNA 结合液（BS），将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，充分混匀， 12000r/min离心1min 6. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入750ul 清洗液 （ WS）, 静

4、置1min，12000r/min离心15s； 7. 重复步骤7一次 8. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管， 12000r/min离心2min 9. 吸附柱放入一个新的1.5ML离心管，在吸附柱的中央加50ul TE buffer,室温放置35分钟。盖好盖子12000rpm 离心1分钟，收集质粒DNA溶液。 10. 取5ul 电泳检查， 琼脂糖凝胶电泳 1. 称取0.7g琼脂糖于锥形瓶中，加入70ml 1TAE溶液，加热至熔化均匀， 2. 加入5l GoldView，将凝胶溶液冷却至50左右； 3. 将制胶板的两端用胶布封住，倒入凝胶溶液（58cm），插入梳齿； 4. 待凝

5、胶凝固后小心拔出梳齿，将凝胶板置于水平电泳槽至，加入足量的1TAE溶液使液面略高于凝胶面2mm； 5. 将DNA样品与溴酚蓝以10 : 1混匀后小心加入凝胶的加样孔中； 2 5V/cm 将电泳槽与电泳仪正确连接，稳压电泳，电场强度约；6. 7. 待溴酚蓝指示剂走到适当位置后停止电泳； 8. 取出凝胶，用水冲洗后于紫外灯下观察电泳结果。 五、实验结果 柱离心法纯化质粒DNA电泳结果图 图1 从电泳结果图可知：由下向上数第四个样品三条带比较明显，如下图： 3 1 2 DNADNA为线性条带,条带为超螺旋3如上图，条带DNA2为开环条带，条带3 条带。 3 六、实验讨论 1、实验中试剂的生化作用原理

6、 1）裂解液（LS）：使染色体DNA变性 2）中和液（NS）：使菌液恢复中性，质粒DNA复性 2、DNA电泳的影响因素： 1. 琼脂糖浓度: 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 2. DNA分子的构象: 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的

7、线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 3. 电源电压: 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 4. 离子强度影响: 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重