第十三章 2 1多肽及蛋白质类药物的生产方法课堂

1、第二节,多肽及蛋白质类药物的生产方法,一、蛋白质类药物的分离与纯化,制造方法：提取分离纯化法、化学合成法、基因工,程,一）材料选择,蛋白质类药物的原料来源有,动植物组织和微生物,等,原则,是要选择,富含所需蛋白质多肽,成分的,易于获,得,和,易于提取,的无害生物材料,对天然蛋白质类药物，为提高,质量,产量,和,降低生,产成本,对原料的,种属,发育阶段,生物状态,来,源,解剖部位,生物技术产品的宿主菌,或,细胞,都有,一定的要求，了解这可使分离纯化工作事半功倍,1,1,种属,牛胰含胰岛素单位比猪胰高，牛为,4000IU,kg,胰脏，猪为,3000IU,kg,胰脏,抗原性,猪比牛的低,前者与,人胰

2、岛素,相比，只有,1,个氨基酸,的差异，而牛,有,3,个氨基酸,的差异,2,发育生长阶段,幼年动物的,胸腺,比较发达，老龄,后逐渐萎缩，因此,胸腺原料必须,采自幼龄动物,HCG,在妊娠妇女,60,70,天的尿中达到高峰；到妊,娠,18,周已降到最低水平。然而,HMC,必须从绝经期的妇,女尿中获取,肝细胞,生长因子,是从肝细胞分化最旺盛阶段的,胎,儿、胎猪或胎牛肝中,获得的。若用成年动物，必须经,过肝脏,部分切除手术后,才能获得,富含肝细胞生长因,子,的原料,2,3,生物状态,动物,饱食后宰杀,胰脏中的胰岛素含,量增加，对提取胰岛素有利，但,胆囊收缩素,的分泌使,胆汁排空,对胆汁的,收集不利,严

3、重再生障碍性贫,血,症患者尿中的,EPO,含量增加,4,原料来源,血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚,下腺中提取，而,稳定性以颚下腺,来源为好，因其不含,蛋白水解酶,5,原料解剖学部位,猪胰脏中,胰尾,部分含激素,较多，而,胰头,部分含,消化酶,较多。如,分别摘取,则可提,高各产品的收率,胃膜素,以采取,全胃粘膜,为好,胃蛋白酶,则以采取胃,底部粘膜,为好，因,胃底部粘膜富含消化腺,3,6,对生物技术产品宿主菌或细胞的要求,选择生物技术产品的,宿主受体菌,或,细胞,也应考虑,到,后处理,的问题,大肠杆菌表达,由于其不能将所表,达的,蛋白质分泌,到体外，故提取时必须,破壁,增加了,提取的困难，而且还

4、可能含有,毒素类,有害因子,用,枯草杆菌或酵母菌,作宿主菌，虽可解决这一矛,盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏,糖基化,等翻译及修,饰的缺陷,用,动物细胞和昆虫细胞表达,则能比较好地解决后,处理及完整表达的问题,用,肿瘤细胞,作宿主细胞制成的医药产品还应考虑,到其,安全性问题,4,蛋白质提取,总要求是最大限度的把有效成分提取出,来，关键是溶剂的选择,常用方法：调整溶剂的,pH,离子强度,溶剂成分配比、温度等,5,二）蛋白质分离纯化的一般方法,根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质：分,子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的,生物亲和力等,1,根据蛋白质,等电点的不同,来纯化蛋白质,蛋白质、多

5、肽及氨基酸都是两性电解质，在一定,pH,环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势,相等，或解离成两性离子，其净电荷为零,此时环,境的,pH,值即为该蛋白质的等电点,在等电点时蛋白,质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度,粘度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质等电点,时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质,6,两性物质的,等电点,会因条件不同（如在不同,离子,强度的不同缓冲溶液,中，或含有,一定的有机溶媒,的,溶液中）而改变,当盐存在时,蛋白质若结合了较,多的阳离子，则等电点向较高的,pH,值偏移,反之,蛋白质若结合较多的阴离子，则等电点移向,较低的,pH,值,用,等电点法沉淀,蛋白质常需配

6、合,盐析操作,而除,去不需要的杂蛋白时，常需配合,热变性操作,等电聚焦电泳,除了用于,分离蛋白质,外，也可用于,测定,蛋白质的,等电点,7,2,根据蛋白质,分子形状和大小的不同,来纯化蛋白质,蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用,凝胶,过滤法、超滤法、离心法及透析法,等将蛋白质与其,他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离,注意,用,超滤法,时，超滤膜截留分子量常与实际情,况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有,呈线,形溶质或者是球形溶质的区别,可能出现不同的结,果,葡聚糖凝胶,含有少量的,酸性基团,故有,较弱的离,子交换作用,此外还有,吸附作用,在纯化蛋白质时,可采用,低浓度的盐

7、溶液,0.01mol,L,或者用与,待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先,使凝胶柱平衡,以期不损失所分离的蛋白质,8,3,根据蛋白质,溶解度的不同,来纯化蛋自质,蛋白质的,溶解度,受溶液的,pH,离子强度,溶剂的,电解质性质,及,温度,等多种因素的影响,在同一特定条,件下，不同蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条,件，可以有选择地控制某一种蛋白质的,溶解度,达到,分离的目的,属于这一类的分离方法有蛋白质的,盐溶,与,盐析法,结晶法,和,低温有机溶剂沉淀法,乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶,剂，由于,丙酮的介电常数,小于乙醇，故,丙酮,沉淀能力,比,乙醇,强,9,4,根据蛋白质,电离性质的

8、不同,来纯化蛋白质,离子交换剂作为一种,固定相,本身具有正离子或负,离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲,和力，从而使这些物质分离提纯,蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团,对,蛋白质的离子交换层析,一般多用,离子交换纤维或以,葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等,为骨架,的,离子交换剂,主要是取其有较大的蛋白质吸附容量,较高的流速和分辨率等优点,对已知,等电点,的物质，在,pH,高于其等电点时，用,阴离子交换剂,在低于其等电点时，用,阳离子交换剂,10,5,根据蛋白质,功能专一性的不同,来纯化蛋白质,主要的手段是,亲和层析,法,即利用蛋白质分子能与,其相应的,配体,进行,特

9、异的,非共价键的可逆性结合,而达到纯化的目的,注意,非专一性吸附主要来自吸附剂上的,离子基团,和,疏水基团,解决这一问题的方法是从制备和选用吸,附剂上着手,固相化金属亲和层析,IMAC,是新发展的一种,亲,和层析技术,蛋白质分子中的,咪唑基和巯基,可与一些,金属元素（如,Cu,2,Zn,2,等）形成配位结合,使蛋,白质得到分离纯化,11,6,根据蛋白质,疏水基团与相应的载体基团结合,来,纯化蛋白质,蛋白质分子上有,疏水区,它们主要由,酪氨酸、亮,氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧,链密集在一起形成,并暴露于分子表面,这些疏水,区，能够与,吸附剂上的疏水基团结合,再通过,降低,介质的离

10、子强度和极性,或用,含有去垢剂的溶剂,增高洗脱剂的,pH,值等方法将蛋白质洗脱下来,用,含酚基疏水基团,的,琼脂糖纯,化重组人表皮生长,因子,rhEGF,，纯度可达,94,回收率达,82,12,7,根据蛋白质在,溶剂系统中分配的不同,来纯化蛋白,质,这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分,配为基础的分离过程，称之为,逆流分溶,利用,逆流分,溶技术,分离垂体激素、氨基酸,DNA,是很有效的,13,8,根据蛋白质,某些特殊性质,来纯化蛋白质,蛋白质易受,pH,温度、酸、碱、金属离子,蛋白沉淀剂、络合剂,等的影响，由于各种蛋,白质都存在着差异，可,利用这种差异来纯化,蛋白质,白蛋白,在,弱酸性

11、条件下,加,辛酸钠,可,耐受,67,的温度,而其他蛋白质将变性,球蛋白或白蛋白在,碱性条件下,可以和,利凡,诺,作用，形成,络合物,而与其他蛋白质分离,细胞色素,C,和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀,剂如,三氯醋酸沉淀,而保存其活力,14,9,根据蛋白质的,选择性吸附性质,来纯化蛋白,质,在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有,结晶磷酸钙（羟灰石,磷酸钙凝胶,硅胶,皂土沸石,硅藻土、活性白土、氧化铝以及,活性炭,等。诸如催产素、胰岛素,HCG,HMG,细胞色素,C,等都可以通过,吸附层析技,术,进行纯化,15,三蛋白质的分离和纯化方法的选择,早期：从低分辨率到高分辨率，而且负荷量较大,为合适,使用

12、顺序,后期保护,对分离纯化每一步的优劣进行综合评价,16,四）溶液中蛋白质浓度的测定,溶液中蛋白质的浓度可根据它们的,物理、化学性,质,如,折射率、比重、紫外光吸收来测定,化学反应方法,如,凯氏定氮、双缩脲反应、福林,酚反应测定,也可用染色法，如,氨基黑、考马斯亮,蓝测定,此外还可用,荧光激发、氯胺,T,放射性同位素计,数等灵敏度较高,的方法,上述方法,紫外吸收法、双缩脲法、福林酚试,剂法、考马斯亮蓝染色法最为常用,17,五）纯度检查,测定蛋白质的,纯度,是,化学和物理学,的概念，它和蛋,白质所具有的,生物活性,有着更复杂的关系，蛋白质的,聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用,等极大,地影响

13、其,生物活性,而这些因素的影响有些往往是用,一般纯度检查的方法所查不出来的，纯度检查的方法,有,1,HPLC,或,FPLC,这是蛋白质纯度检查常用的有效方法。美国药典,已规定把,HPLC,用于胰岛素纯度的检测项目中,18,2,电泳法,3,免疫化学法,适用于产生特异性抗体的蛋白,4,生物测定法,利用动物体或动物的,离体器官、细胞进行生物,效价的测定,这种方法接近动物临床所产生的,生物,学效应,因此实际意义也更大,5,分光光度法,1,紫外分光光度法,2,红外分光光度法,蛋白分子结构有特别能级,红外提供分子指纹,19,二、多肽与蛋白质的化学合成,多肽的合成是,50,年代开始，在,有机溶剂中,进行的,

14、均相反应,因此叫作,液相合成法,此法在合成分子,量不太大的多肽时是比较成功的，但在合成更大的,蛋白质时，产物还不能,表现出全部活力,且,不能结晶,1962,年建立的,固相合成,的,新方法,对小肽的合,成是很成功的，对大分子的合成，如,124,肽,的核糖核,酸酶，还不能达到,天然物质的全部活力,目前试图合成大的蛋白质以及,建立快速简便的合,成方法,是多肽合成化学的,特征,20,在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤,氨基保护和羧基活化,羧基保护和氨基活化,接肽和除去保护基团,一）基团保护,要实现控制多肽合成，如,N,末端,氨基酸残基的自,由,NH,2,C,末端,氨基酸残基的自由,COOH,以及侧

15、链,上的一些,活泼基团,加以,封闭或保护,待肽链形成,之后，再将保护基除去。作为保护基,必须既能在,接肽时起到保护作用，在接肽以后，能很容易地除,去，且不致引起肽链的断裂,21,应用最多的,氨基保护剂,是,苄氧羰酰氯,Cb,z,Cl,可用,催化氢化法,或,钠氨法,用金属钠在液氨中处理,除去保护基,也可用,叔丁氧羰酰氯,BOC-Cl,作,保,护剂,用,稀盐酸或乙酸,在,室温除去保护基,羧基保护剂,通常用,无水乙醇或甲醇在盐酸存在,下,进行,酯化,使羧基,接上烷基,除去保护基可在常温下,用,氢氧化钠皂化法,有些,氨基酸,还有其他,功能基团,在合成肽时，都,要用适当的保护基团加以保护。例如组氨酸的,

16、咪唑基,丝氨酸的,羟基,酪氨酸的,酚基,半胱氨酸的,巯基,等,都可用,苄基,B,2,保护,用,钠氨法,除去。谷氨酸和,天门冬氨酸的,及,羧基,可用,及,苯甲酯,保护，用,催化氢化法,除去。精氨酸的,胍基,用,对甲基磺酰基,Tos,保护,22,二）肽的液相合成法,接肽反应除用,缩合剂,来完成外，还可以用分别活,化参与形成肽链的,氨基和羧基,的方法来完成。因,活,化氨基,的反应激烈，而且常常产生,消旋化,所以,总是采用,羧基活化,的方法，合成肽的常规方法是从,C,端向,N,端进行,肽的合成法可分为,阶梯伸长法,和,片断缩合法,阶梯伸长法,是将带有,R-O-CO,型保护基,的氨基酸,不是肽）的羧基活

17、化，从肽的,C,端开始每次接上,一个氨基酸，逐步递增的办法。这是合成比较小的,肽或肽段常采用的方法,23,片断缩合法,由小肽合成大肽时常用,叠氮法,因叠氮法有较好的,产品光学纯度（不消旋,由小肽接成大肽时，为了保证光学纯度，应尽量利,用,Gly,和,Pro,这两个氨基酸的,C,末端接肽,24,三）肽的固相合成法,在固相合成中，肽链的延长是在不溶性的,聚苯,乙烯树脂载体上进行的,合成多,肽,的,C,末端,先和氯,甲基聚苯乙烯树脂（氯化苄酯树脂）反应形成,苄酯,然后按,肽,链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨,基酸逐个加上去，使肽链延长,固相法比液相法操作简便，时间缩短,可以自动,化,在我国医药工

18、业用。人工合成催产素、促黄体,生成素释放因子,LRH,，不仅产量高，而且比天,然产品好,25,26,多肽类药物,一）概述,活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域，生,物体内已知的,活性多肽主要是从内分泌腺、组织器,官、分泌细胞和体液中产生或获得的,许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的,蛋白质前,体,经过,酶的加工剪切,转化而来的有共同的来源,相似的结构，保留着若干彼此所特有的,生物活性,研究,活性多肽结构,与,功能,的关系及活性多肽之,间,结构的异同与其活性的关系,将有助于,设计和研,制,新的活性多肽药物,27,多肽药物的种类,1,多肽激素,2,多肽类细胞生长调节因子,3,含有多肽成分的其他生化

19、药物,28,二、主要多肽类药物的制备,一）胸腺激素,Thymus,hormones,胸腺是一个激素分泌器官,对,免疫功能,有多方,面的影响,胸腺依赖性,的,淋巴细胞群,T,细胞,直,接参与有关免疫反应,胸腺对,T,细胞发育的控制,主要通过由胸腺所产,生的,一系列胸腺激素,促使,T,细胞的前身细胞,前,T,细胞分化、增殖、成熟,为,T,细胞的各种功能亚群,由此,控制调节免疫反应的质与量,现已知某些,免疫,缺陷病,自身免疫性疾病,恶性肿瘤,以及老年性退,化性病变等皆与,胸腺功能,的减退及血中,胸腺激素,水,平的降低有关,29,1,胸腺素,Thymocln,胸腺激素制剂,总的说来,都与调节免疫功能有

20、关,1,结构和性质,胸腺素组分,5,是由在,80,热稳定,的,4050,种,多,肽,组,成,的,混,合,物,分,子,量,在,1000,15000,之间,等电点在,3.5,9.5,之间,为了便于不同实验室对这些多肽的,鉴别和比较,根据它们的,等电点,以及在,等电聚焦分离,时的顺序而命,名。共分,三个区域,区,包括等电点,低于,5.0,的组分,区,包括等电点在,5.0,7.0,之间,的组分,区,则指其等,电点在,7.0,以上,者（此区内组分很少）。对分离的多,肽进行免疫活性测定,有活性的称为胸腺素,30,2,生产工艺,工艺路线,31,工艺过程,提取,匀浆、离心,加热去杂蛋白,提取液,80,加热,1

21、5min,沉淀,10,丙酮,超滤,取分子量在,15000,以下的超滤液,脱盐、干燥,超滤液经,Sephadex,G-25,脱盐后,冷冻,干燥,得胸腺素,3,检验方法,活力测定,E,玫瑰花结升高,百分数,不得低于,10,分子量,15000,以下,4,作用与用途,为免疫调节剂,32,2,胸腺肽,Thymus,peptides,1,结构和性质,胸腺肽中主要是,分子量,9600,和,7000,左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸组成达,15,种,必需氨基酸含量高，还含有,RNA,0.2,0.3mg,mg,DNA0.12,0.18mg,mg,对热较稳定,加,温,80,生物活性不降低。经,蛋白水解酶,作用，生,

22、物活性消失,33,二）降钙素,Calcitonin,CT,1,结构和性质,降钙素,是一种调节血钙浓度的,多肽激素,由,甲状,腺,内的,滤泡旁细胞,C,细胞,分泌。是由,32,个氨基酸,残基组成的,单链多肽,降钙素肽链的,脯氨酸端,与生物,活性有密切的关系,去掉,脯氨酸则失活,降钙素分子量约,3500,溶于水,和,碱性,溶液,不溶,于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳,等，难溶于有机酸。水溶液中,210,可保存,7,天,降钙素,在人及哺乳动物体内，主要存在于,甲状腺,甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织,中，鱼类则在,鲑、鳗,鳟等的终鳃体,里含量较多。各种不同动物来源的降钙,素，氨基酸,排列顺

23、序有些差异,34,2,生产工艺,制造降钙素的原料主要有,猪甲状腺和鲑、鳗的心,脏或心包膜,用,化学合成,和,基因工程技术,制备降钙,素已获成功,35,3,检验方法,生物活性测定方法,样品用经过,0.1mol,L,醋酸钠,溶液稀释过的,0.1,白蛋白溶液溶解，取,0.2ml,样品按,倍比稀释法配制，选用雄性大白鼠,静脉注射,1h,收,集血液,血样品的血清钙值采用,原子吸收光谱法测定,对照采用,MRC,标准品，该标准品是从猪甲状腺中提,取的,将标准品,稀释至所需要的稀释度,2.5,5,10,和,20MRCmU,0.2ml,然后,用同样方法给大鼠注射,1,小时后测定血清钙值,根据标准品测定样品的生物

24、,活性,36,4,作用与用途,降钙素的主要功能是,降低血钙,降钙素抑,制骨的吸收，又能抑制骨自溶作用，使骨骼释,放钙减少，同时骨骼不断摄取血浆中的钙，导,致血钙降低，降钙素还可抑制骨盐的溶解与转,移，抑制骨基质分解，提高骨的更新率，增加,尿钙、尿磷排泄，引起低钙血症或低磷血症,在体内的降低血钙作用很短暂，降钙素可对抗,甲,状,旁,腺,激,素,对,骨,骼,的,作,用,37,蛋白质类药物,一、概述,现正从,微生物和动物细胞,的,表达,转向,基因动植物,发展。鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的,抗原,性,容易失活,在体内的,半衰期短,用药途经,受限,等难以克服的缺点，对一些蛋白质生化药物进行,结构

25、,修饰,应用计算机图像技术研究,蛋白质,与,受体,及药物,的相互作用、发展,蛋白质工程,及设计相对简单的小分,子来代替某些大分子蛋白质类药物，并且起到,增强或,增加选择性,疗效的作用等，已成为前瞻性的重要任务,之一,38,主要蛋白质类药物有以下几类,1,蛋白质激素,2,血浆蛋白质,3,蛋白质类细胞生长调节因子,4,粘蛋白,5,胶原蛋白,6,碱性蛋白质,7,蛋白酶抑制剂,8,植物凝集素,39,二、主要蛋白质类药物的制备,一）白蛋白,Albumin,1,结构和性质,白蛋白,又称,清蛋白,是血浆中含量最多的蛋白质,约占,总蛋白的,55,同种,白蛋白制品,无抗原性,主要,功能是维持,血浆胶体渗透压,白

26、蛋白为,单链,由,575,个氨基酸,残基组成，分子量,为,65000,pI4.7,沉降系数,S,20,w,4.6,电泳迁移,率,5.92,可溶于水和,半饱和,的硫酸铵溶液中，一般当,硫酸铵的饱和度为,60,以上时,析出沉淀,40,对酸较稳定,受热,后可,聚合变性,但仍较其他,血浆蛋白质,耐热,蛋白质的,浓度,大时,热稳定性小,在白蛋白溶液中加入,氯化钠,或,脂肪酸的盐,能提高,白蛋白的,热稳定性,可,利用这种性质,使白蛋白与,其他蛋白质分离,白人血浆中分离的白蛋白有,两种制品,一种是从健康人血浆中分离制得的，称,人血清白,蛋白,另一种是从健康产妇,胎盘血,中分离制得的，称,胎,盘血白蛋白,制剂

27、为,淡黄色,略粘稠的,澄明液体,或,白色疏松状,冻干）固体,41,2,生产工艺,1,工艺路线,2,工艺过程,提取、分离、精制,利凡诺沉淀,弱酸性，氯化钠,超滤器浓缩,热处理,灭活病毒,除菌（过滤,42,二）干扰素,Interferon,IFN,1,结构和性质,干扰素,IFN,系指由干扰素诱生剂诱导有关,生,物细胞,所产生的一类高活性、多功能的,诱生蛋白质,这类,诱生蛋白质,从细胞中,产生和释放,之后，作用,于相应的其他,同种生物细胞,并使其获得,抗病毒和抗,肿瘤,等多方面的,免疫力,人干扰素按抗原性分为,三型,根据氨基酸序列的差异，又分为,若干,亚型,已知,IFN,有,23,个以上的亚型,IF

28、N,的基因,位于第,9,对染色体上，而,IFN,的基因位于第,12,对染色,体上。三种干扰素的理化及,生物学性质,有明显差异,即使是,IFN,的各亚型之间，生物学作用也不尽相同,43,2,生产工艺,我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰,素的方法，达到,10,6,U,mg,蛋白的水平。基因工程,干扰素我国已于,1989,年转入中试,1990,年获得生产许,可证而进入工业化生产阶段,1,工艺路线,44,2,工艺过程,含有,ACD,抗凝剂,塑料袋,氯化铵处理溶血,起,动诱生,正式诱生,仙台病毒,在,10,天龄鸡胚中培养,48,72h,收获尿囊液,3,检验方法,国际上规定，能保护,50,细胞免受

29、病毒攻击的浓度即,为一个,IFN,活性单位。我国用微量板染色的病变抑制,法测定，具有操作方便、节约材料、快速、结果可靠,重复性好及便于保存标本等优点,45,本法测定,干扰素可任选用,Wish,细胞,A549,细胞和,Hep-2,细胞，细胞浓度,40,万个,ml,左右，病毒,为水泡口炎病毒,VSV,。方法为：将细胞在微量,板上培养，分别加测定样品和,IFN,标准品，待细胞已,成单层即可攻毒，约,24,30h,待病毒对照的细胞几乎,全部病变时，即可进行染色，在,550nm,波长比色，计,算出,IFN,单位效价，再将测得的单位校正为国际单位,46,4,作用与用途,由于干扰素的抗病毒、抗细胞分裂及免疫

30、调节作用,可用于,1,病毒性疾病,普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱,疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎,2,恶性肿瘤,成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤,黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌、鼻咽癌等,可获得部分缓解,3,用于病毒引起的良性肿瘤可控制疾病发展,47,三）胰岛素,Insrlin,胰岛素广泛存在于人和,动物的胰脏,中，正常人的,胰脏约含有,200,万,个胰岛，胰岛由,和,三种细胞,组成,其中,细胞制造,胰岛素,细胞制造,胰高血糖,素,和,胰抗脂肝素,细胞制造,生长激素抑制因子,胰,岛素在,细胞中开始时是以活性很弱的,前体胰岛素原,存在的，进而,分解,为胰岛素进入血液循环,1,结构和性质,胰岛素由

31、,51,个氨基酸组成,不同种属动物的胰岛素,分子结构大致相同,主要,差别在,A,链二硫桥中间的第,8,9,和,10,位上的三个氨基,酸及,B,链,C,末端，人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸,抗原,性比,其他来源的胰岛素要低,48,49,50,胰岛素的性质有,牛胰岛素的分子量为,5733,猪为,5764,人为,5784,胰岛素的,等电点为,5.305.35,胰岛素在,pH4.5,6.5,范围内几乎不溶于水,易溶于,稀酸或稀碱溶液；在,80,以下乙醇或丙酮中溶解,在,90,以上乙醇或,80,以上丙酮中难溶,在,乙醚中不溶,在,高浓度锌,的溶液中,pH6,8,时胰岛素溶解度急,剧下降,2,生产工艺,胰岛素

32、在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定,51,工艺路线,52,3,注解,1,离体后,蛋白水解酶,类能分解胰岛素使之失活,因此，要立即,深冻，先在,30,以下急冻后转入,20,保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好,在胰脏中,胰尾部分胰岛素含量较高,如,单独使,用可提高收率,10,2,胰岛素结构修饰,可对胰岛素分子进行修饰和,改造，以改变某些性质，如,提高降血糖能力,延长体,内,半衰期,抗热变性,抗蛋白水解酶的降解,等,53,3,酶促半合成人胰岛素,经,胰蛋白酶,的,转酰胺作,用,将,猪胰岛素,转化,为人胰岛素,B,30,再用,离子交换,层析纯化,可得到高纯度人胰岛素,4,重组,DNA,技术制造人胰岛

33、素，人工合成的人胰,岛素克隆到大肠杆菌中生产人胰岛素,54,55,基因表达,容易进行,DNA,重组技术操作,用于基因表达的宿主细胞分为,两大类,第一类为原,核细胞,目前常用的有,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌,链霉菌,等,第二类为真核细胞,常用的有,酵母、丝,状真菌、哺乳动物细胞,等,宿主细胞的选择,1,大肠杆菌,2,枯草芽孢杆菌,3,链霉菌,56,2,真核细胞,1,酵母,2,丝状真菌,3,哺乳动物细胞,4,检验方法,胰岛素效价测定，各国药典规定有家免血糖降低法,和小鼠血糖降低法,5,作用与用途,胰岛素是调节血糖水平的重要激素，能使血糖降低,57,四）生长素,Growth,hormone,GH,1,结

34、构和性质,人的生长激素是由一条,191,个氨基酸,的多肽链所构,成的蛋白质,等电点,4.9,猪为,6.3,沉降系数为,S,20W,2.179,N,端的,1,134,氨基酸,段肽链为活性所必需,C,端,的一段肽链,可能,起,保护作用,使生长激素在血循,环中不致被酶所破坏,人生长激素分子相当稳定，其,活性在,冰冻条件下,可保持,数年,在,室温放置,48h,无变,化,只有,灵长类,的生长激素,对人有活性,58,生长激素与催乳素,的肽链氨基酸顺序约有,近一半,是相同的，因此，生长激素具有,弱的催乳素活性,而催乳素也有,弱的生长激素的活性,59,2,生产工艺,1,工艺路线,60,2,注释,水,0.1,m

35、ol/L,洗涤,0.25,mol/L,抽提,硫酸铵,分级沉淀除杂,分子筛,DEAE-C,层析,强碱,用与,展层剂相似的,透析外液,hGH,的种属特异性很强,目前用枯草杆菌系统表达,hGH,的最高产量达,1.5g,L,用,大肠杆菌,生产的,hGH,及用哺乳动物细胞生产的,hGH,比垂体提纯的天然,hGH,多一个蛋氨酸,其治,疗效果更为显著,61,4,检验方法,GH,生物测定用鹤子嗉囊法及大白鼠尾骨法,5,作用与用途,62,五）胃膜素,Gastric,mucin,1,结构和性质,胃膜素是从猪,胃粘膜,中提取的,一种,以,粘蛋白,为主要,成分的药物,胃膜素着水后膨胀成为粘液,遇酸即沉淀,遇热不,凝固,胃膜素水溶液能,被,60,以上乙醇或丙酮,沉淀,胃膜素与酸,较长时间,作用，能,分解,成各种蛋白质和,多糖组分。胃膜素的,等电点为,pH3.3,5,63,2,生产工艺,目前生产胃膜素的工艺以,联产,最为可取,1,工艺路线,64,2,工艺过程,消化,氯仿脱脂,分层,丙酮分级沉淀胃膜素、胃蛋白酶,3,检验方法,目前我国质量标准各地尚不一致,4,作用和用途,胃膜素中的