western显影时荧光淬灭太快原因及对策

1、western显影时荧光淬灭太快原因及对策降低二抗浓度，然后这样做：在一张保鲜膜上面把NC膜铺上去，然后直接在NC膜上加入发光液（可以是理论量的一半，否则后面盖上膜后会溢的到处都是），不要吸干直接将保鲜膜盖上拿去显影，可以托比较长的时间（当然，淬灭的主要原因是单位面积上HRP的高度密集，使NC膜上残留的发光液被高速消耗，所以上面这个方法的原理就是降低NC膜单位面积上HRP的密度，同时提供尽可能多的发光反应液，使反应不会在短时间内结束但是即便如此还是建议尽快压片！）在显影底物用到快见底的时候，我也遇到过这样的情况，后来用新的一瓶又持续发光超长时间，所以推测是显影底物不行了。哪些因素会影响荧光信号

2、的强弱呢？（这部分实际上与导致荧光淬灭的因素部分重合）1.保鲜膜的质量。a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL反应不充分，另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒（也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶，荧光转瞬即逝。b. 保鲜膜的化工原料或拉制过程中，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。目前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学

3、物残留都不影响ECL显影。如果买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别注意这些支持物表面的干净，最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST盐结晶颗粒。2.ECL孵育结束后膜需要控干。中学物理学过水会吸收光谱，因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请注意不能让膜完全干掉。某些信号较弱的ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；较好的试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。因此，按照我的方法，让自由流下的多余的ECL被吸走就好。3.控干的膜要仔细用保鲜膜包被

4、，防止接触外界异物造成荧光淬灭；同时，包裹保鲜膜时要细心，尽量不让正面保鲜膜和膜之间出现皱褶。皱褶的地方会堆积多余的ECL，要么形成一条荧光的亮线；要么由于液体吸收荧光或者局部区域HRP过度消耗，呈线条状淬灭。4.在膜放入压片夹之前，最好肉眼观察一下荧光信号的强弱，这有利于判断实验可能出现的问题。很多人提问看见很强的荧光了，但怎么压片都没有信号，那么就是快速淬灭（闪灭，再怎么快速操作也拿不到这种情况下的荧光信号）造成的；有这个观察至少能够判断ECL孵育之前实验操作应该问题不大，而问题主要是淬灭。如果你省略这个步骤，那问题就非常复杂了，因为之前任何操作都可能导致白板，根本无法判断。除上述的问题以

5、外，还有哪些因素会导致荧光淬灭呢？1. 抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。在电泳的章节就曾提过，如果上样量太大，不仅条带会粘连、弯曲，更可能导致淬灭。因为局部区域过多的HRP酶会快速消耗底物呈富氧态，条带出现烧灼样（取出膜会发现一条明显的暗黄色的带），荧光信号会闪灭或者条带空心（条带灰黑不实，则可能是显影液接近失效）。2. 抗原浓度太低，荧光信号太弱，相对慢一点的淬灭。可能第一次压片能够获得很弱的条带，随后都不可见。3. ECL试剂质量。除过氧化物因接触空气被逐渐还原外，ECL的成分通常都不稳定。如呈递电子跃迁能的中间递质其化学性质就不太稳定，因为它转换能量的特性决定其必是一个有中间态的化

6、合物，长期接触空气会被逐渐氧化失效；luminol也有保质期。4. 操作时间过长，膜逐渐彻底干掉。商品化的ECL会出现波形渐变，开始信号逐渐增强，背景一起升高；随后荧光完全衰减淬灭。5.不良的实验习惯。坛子上曾经有人问及淬灭问题，提到显影夹子很脏。脏的显影夹主要有两种污染，铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，前者造成闪灭（催化作用），后者可能直接导致无荧光；只要有任何失误，诸如不小心刮破保鲜膜，保鲜膜包裹不严实（其实通常还真的不严实，因为你不可能包裹好几层）。于是，我问他用一个很脏的东西不觉得很别扭嘛，为什么不先抄起抹布擦干净再用呢。6.淬灭的假象。少量沾在膜表面的二抗也会激发荧光，但ECL孵育时

7、稍微晃动就消失了，可能产生淬灭的错觉。化学发光很快淬灭的原因很可能是由于你的HRP反应过于强烈所致(如蛋白上样量过高、一抗和二抗的浓度太高)。我本人也有这样的体会，尤其是做如GAPDH这样的表达量很高的蛋白的时候，如果抗体的稀释倍数和以前的一般条件一样的话，就会出现你说的这种情况。最后的结果是在暗室里紧张得满头大汉却只保住有限几张的片子。而且在这种情况下，PVDF膜上也能看到淡黄色的条带Q：为什么Western Blot化学发光(ECL)会出现高背景？A：Western Blot发光经常有“背景太高”问题，导致“背景高”的原因有很多，主要有以下几个方面：. 抗体浓度过高，洗涤不充分，可以造成抗

8、体在膜上的非特异结合，导致高背景。可通过降低抗体稀释度，增加洗膜次数和Buffer用量，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20加以改善。. 封闭不充分，会造成抗体在膜上的非特异结合，导致高背景。可通过4封闭过夜或增加封闭液中的蛋白浓度加以改善。. 使用了不恰当的封闭剂，可尝试不同的封闭剂。. 曝光过度，可减少底物显色时间，缩短曝光时间。. 操作过程中膜干了。确保膜完全浸没于buffer中，始终杜绝膜干。Q：Western Blot发光时为什么会发生荧光“淬灭”？A： 荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快

9、就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面:. 抗原浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗原上样量。. 抗原浓度太低，荧光信号太弱，可能第一次压片能够获得很弱的条带，再压片就没有什么条带都没有。. 操作时间过长，膜逐渐干掉。避免膜干掉。. 不良的实验习惯导致设备或试剂污染。例如铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，会造成荧光淬灭，甚至直接导致无荧光；Q：Western Blot化学发光(ECL)时，胶片上条带很浓怎么办？A：可通过以下几个方面进行改进：. 可减少蛋白上样量；. 降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间；.

10、如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。Q：Western blot化学发光(ECL)时，胶片上条带很弱，这是什么原因？A：条带弱的原因可能有以下几个方面：. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整。. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。. 抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活。可考虑更换效价更高的抗体，或提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交实验确定抗体活性。. 曝光时间太短。可适当延长曝光时间。Q：Western blot化学发光(ECL)时，出现非特异条带，应该怎么办？A：出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面：. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。. 目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖