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文档简介
1、实用标准文案3T3-L1细胞实验操作3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞(前脂肪)培养基配制(准备1L高压过的超纯水)1、 DMEM粉倒入1L放旋子的烧杯,加灭菌水1000ml,盖锡纸磁力搅拌40分钟。2、擦净,加入3.7g Na 2CO3,盖锡纸磁力搅拌10分钟。3、称2.38g HEPES (4C保存),盖锡纸磁力搅拌 20分钟。4、 拿过滤嘴、针筒,用针筒吸配好的培养基,通过滤嘴过滤至高压过的100ml瓶分装,4 C保 存,用时加10ml血清配成10%FBS。顺便先配诱导液:配好的培养基分装入100ml瓶中,90mlDMEM 。准备好 FBS、IBMX、DEX、insulin (2 曲/ml
2、)先配两瓶100ml 10%FBS ,A 液:IBMX 1ml + DEX 100 讪 + insulin 250 讪 入 100ml 10%FBSB 液:insulin 250 讪 入 100ml 10%FBS(先过滤)细胞冻存(全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)1、准备DMEM (分装好的)* 1瓶,50 ml瓶* 2,针,过滤器* 1,DMSO试剂,冻存管。2、配冻存液(10ml ):按5: 4: 1比例 培养基5ml :血清4ml : DMSO 1ml ,混匀。3、拿出一个新的、标记好用 针筒 把 过滤器 弄在 瓶口用 针筒 吸 新配的冻存液,把针头 摘 掉,经过滤器把新配的冻
3、存液滤到新瓶。4、PBS清洗细胞,加完盖盖子,加在壁上,然后吸弃,换枪头吸(一对一)5、吸 胰酶500山(吸匀再用),放显微镜观察,消化完毕即吸弃(一对一)6、 大皿加入23ml冻存液,打圈吹散,分装1ml至冻存管,勿离心。7、-4 C 30min , -20 C 1h,-80 C 2h,最后液氮冻存。一、细胞复苏(准备10%FBS、晚上复苏)1、将从液氮取出冻存管放入 37 C恒温水箱搅拌解冻。2、将细胞悬液软管吸取至培养皿中,加入 56 ml10%FBS,混匀3、培养过夜后进行换液。二、细胞传代(全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)10%FBS 即90mlDMEM + 10ml 血清
4、半个月内用完1、缓慢吸走旧培养基,换枪头,用 2ml DMEM 清洗,后吸弃。2、加500讪胰酶,在显微镜观察细胞形态,大部分消化成方形即可吸弃胰酶。3、加入2ml10%FBS,打圈混匀,吸1ml,每皿大概56滴入新的培养皿(大皿10滴1ml ),其余弃掉,后加3ml10%FBS (大皿8ml ),大概可2天传代。4、 换液时需缓慢吸弃旧培养基,DMEM清洗细胞(注意换枪头杜绝污染)后吸弃,10%FBS贴 壁加入3ml。三、细胞接板(全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)24孔板:560山细胞+6ml 10%FBS(12个样)【600山 分化1.2ml增殖】12 孔板:1400 pl 细胞
5、 +11ml 10%FBS用25ml瓶一板对一瓶装1、准备好12孔板、24孔板各两份(两皿细胞)、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。2、配 10%FBS 90ml DMEM+10ml 血清3、第一二瓶 各6ml 10%FBS,第三四瓶 各11ml 10%FBS4、 吸弃旧培养基,力卩2ml DMEM 摇晃清洗,吸弃,500山一皿细胞胰酶消化,显微镜观察细胞 分散开来即停止消化。5、每皿加入2ml 10%FBS,1ml枪头打圈吹散。6、将两皿细胞集中在一个培养皿,打圈吹散。7、560山细胞分别加入一二瓶混匀,1400山细胞分别加入三四瓶混匀。8 二瓶对应加500山细胞进24孔板(加12个孔)
6、摇晃混匀,三四瓶对应加1ml细胞进12孔板,摇晃混匀。放培养箱, 第二天进行转染。四、细胞转染(无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)1、 准 Opti-MEM,灭菌水,mic (inhibitor ),NC,Lipo3000,无酶 EP 管、无酶小管,96孔枪头板,12孔板、24孔板各2板(工具照紫外)2、NC、mic (inhibitor ) 4 C 1500r 1.5min 离心3、 分装Lipo3000 tube 管150讪一管(轻混),mic (inhibitor )、 NC小管(换枪头加灭菌水稀释,按说明书要求),标记好4、 分装Opti-MEM 20ml
7、入瓶待用5、 计算好体系:(n为样品数量,N为总样品数量)Mic :45 山 + 600 山 Opti-MEM (12 孔板)-3.75 讪 Mic * n + 50 Opti-MEM * n ; 22.5 pl + 300 山 Opti-MEM (24 孑L板 12 个样)-1.875 d Mic * n + 25Opti-MEM * nNC :45 讪 + 600 讪 Opti-MEM (12 孔板)-3.75 讪 NC * n + 50 讪Opti-MEM * n ; 22.5 pl + 300 山 Opti-MEM (24 孔板 12 个样)-1.875 d NC * n + 25 p
8、lOpti-MEM * nLP:84 d + 1200 讪 Opti-MEM (12 孔板)-3.5 d LP * N + 50 plOpti-MEM * N;36 d + 600 d Opti-MEM (24 孔板 12 个样)-1.5 d LP * N + 25 讪Opti-MEM * NInhibitor : 90 d + 600d Opti-MEM(12孔板)-7.5讪 inh * n+ 50dOpti-MEM * n ; 45 d + 300d Opti-MEM(24孑L板 12 个样)-3.75d inh *n + 50 dOpti-MEM *nNC :90 讪 + 600 d O
9、pti-MEM(12 孔板)-7.5 d NC * n+ 50 dOpti-MEM * n; 45 d + 300d Opti-MEM(24孔板 12 个样)-3.75d NC *n + 50 dOpti-MEM *nLP:84 d + 1200 讪 Opti-MEM (12 孔板)-3.5 d LP * N + 50 dOpti-MEM * N36 d + 600 d Opti-MEM (24 孔板 12 个样)-1.5 d LP * N + 25 dOpti-MEM * N6、标记好tube管: mic 45 d + 600 d ; mic 22.5 d + 300 d; NC 45 d
10、+ 600 d; NC 22.5 d + 300 d; LP 84 讪 + 1200 d;LP 36 d + 600 讪。in 90 d + 600 d : in 45 讪 + 300 d; NC 90 d + 600 d ; NC 45 d + 300 d ; LP 84 讪 + 1200 d;LP 36 d + 600 讪。注意:LP需轻轻混匀,平均分至;平均分至,加后轻轻混匀。静置5min ,拿出接板后的12孔板、24孔板细胞观察。7、将旧培养基吸弃,12孔板 每孔1ml Opti-MEM + 100 d转染液;24孔板 每孔500 dOpti-MEM + 50 山转染液(12个孔)&加
11、完晃匀,6h后换10%FBS,放培养箱42h后换诱导液开始进行诱导五、细胞诱导分化(全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)配置储备液:IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量:222.2g/mol(Sigma:l5879 ) -20 C保存(难溶最后溶)用二甲基亚砜 DMSO 配制111.1mg/ml(0.5mol/L )储存液即:0.0115g IBMX + 940 ul ddH2O + 60 ul KOH需用滤嘴过滤至新瓶子终浓度为0.5mmol/L。(现配现用)DEX :分子量:392.5g/mol(Sigma:D4902 ) -20 C保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol
12、/L) 储存液即:o.2mg DEX + 0.5ml无水乙醇终浓度为1umol/L。Insulin : 25mg Insulin + 12.5ml HCl溶解后过滤,PCR小管分装, 终浓度为2ug/ml , -20 C保存。1、 待3T3-L1细胞在24孔板,毎板100讪原细胞体积+400讪10% FBS养2天长满,配制 诱导液 诱导3T3-L1分化。(先配好10%FBS两瓶100ml的)2、 将旧培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,加入配制好的诱导液I每孔500 pl于24孔板 中,培养2天。3、将培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,用200ul的枪头慢慢加入配制好的诱导液II每孔
13、500讪于24孔板中,培养2天。4、将旧培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,用10%FBS培养基培养2天。5、细胞油红0染色的操作步骤: 、10%中性甲醛的配制材料:中性甲醛(多聚甲醛)密封瓶。方法:称取1g中性甲醛粉末,加入10ml的超纯水中,密封,在60度水浴中过夜才能溶解。配 好的溶液1个星期内有效,最好4度保存。 、染色液的配制材料:油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴方法:称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉,溶于少量异丙醇中,然后加异丙醇至 100ml,60 C 水浴溶解,棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4 C保存,为储存液,可长期保存。用时取 6ml加超 纯水4ml混匀,滤
14、嘴过滤,稀释后数小时内用完。1、吸弃培养基,用PBS洗2遍,加入10 %的甲醛固定30min1h (贴壁加),期间过滤油红2、吸弃10%甲醛,用超纯水洗2遍,60%异丙醇孵育5min3、吸弃60%异丙醇,均匀覆盖oil red O 染20min (6孔板2ml,12孔板1ml , 24孔板500M)4、吸弃oil red O 后,用超纯水洗25遍,直至无污点5、加苏木精孵育细胞1min ,吸弃苏木精,超纯水25遍6、在细胞上加超纯水观察若转染诱导成功,重新转染诱导一批细胞,进行一系列实验:流式细胞术:(无酶枪头、1.5mltube管)注意用前灭菌1、准备接板好的12孔板细胞、无酶枪头、tube
15、管、96孔板。2、 摆好12个tube管,把原来1ml 10%FBS培养基吸至tube管,一组一枪头,吸1ml PBS 清洗细胞(悬空加)。吸弃 PBS, 组一枪头,吸100150山胰酶消化细胞(两排两排消化), 显微镜观察第一个,吸弃胰酶,将原培养基从 tube管一一对应吸回去12孔板,并吹匀细胞,轻 轻吹打。显微镜观察是否吹匀。3、将消化并吹匀的细胞悬液吸回去 tube管,一对一,3000g离心5min。4、吸上清,留沉淀,大概留 50山,调950山吸弃上清。5、悬空加入4 C冷却的PBS 1ml,吹匀细胞,3000g 离心5min,吸弃PBS (950山+50讪两次 小心吸弃)。6、加3
16、00山4 C冷却的PBS,吹匀细胞,避免成团。7、 缓慢悬空加入700山预冷的70%无水乙醇,轻轻吹打均匀,4C保存(可一周)。PI染色:1、准备好染色剂、25ml用锡箔纸包好的小瓶、24孔板、锡箔纸。算好体系,多配一个样,加入小瓶备用。现配现用,当天使用,4 C保存:染色缓冲液(n+1 ) * 0.5 ml-20 C *碘化丙啶染色液(20x)(n+1 ) * 25山保存RNase A (50x )(n+1 ) * 10 山避光配制Total(n+1 ) * 0.535 ml 先加多后加少 容易混匀2、 将样品5000g离心6 min,沉淀细胞。小心吸除上清,850山+50讪吸弃上清,预留5
17、0山 左右的乙醇,以免吸走细胞。3、 加入4C PBS,洗涤一次,离心5000g 5 min,沉淀细胞,小心吸除上清,850山+50山吸 弃上清,预留50讪左右的PBS,以免吸走细胞。4、轻轻弹击tube管底,使细胞分散,避免成团。5、 染色:每管样品中加入0.535 ml染色液,缓慢并充分重悬细胞,37 C避光(样品放入24孔 板用锡箔纸包好)温浴(放烘箱)30min,随后4 C或冰浴避光(样品垂直插入携带冰箱内冰)存放。染色完成后宜24h内或当日完成检测,最好当天完成CV变异系数CV越低,峰值越好,越尖锐,5%左右效果较好,一般V 10%即可提RNA 的收样(无酶枪头、1.5mltube管
18、)注意用前灭菌 一组组分好不同枪头吸弃培养基,加入 500 d RNAiso放5min。 标记好无酶1.5mltube管,反复刮取、吸取细胞,将细胞移至 tube管(不同组必须换枪 头,移完盖好)。 收样存放-80 C。RNA提取(无酶枪头、1.5mltube管) 从-80 C冰箱取出样品J 静置 5min 后 12000r,4 C 离心 10min 上清移至新的1.5ml tube管并标记好1J加入丄RNAiso Plus等体积的 氯仿(一般为100 d)震荡摇匀5 室温静置5minM2000r,4 C 离心 15min 将上清转移至新的tube管并标记好 (150200 d)J加与上清液等
19、体积的异丙醇,颠倒混匀 室温静置10mi nM3000r,4 C 离心 10min 弃上清,向沉淀加入1ml的75%乙醇颠倒清洗沉淀文档实用标准文案(离心时以管头朝内侧,贝翫淀会附于管外侧,加入乙醇时从内侧,勿触沉淀,设阴性对照,即 横板为dH20)M3000r,4 C 离心 10min 弃上清,留沉淀M4000r,4 C 离心 3min 吸走多余的75%乙醇J操作台风干2min 各加入8山DEPC溶解检测纯度:打开软件一按“ Acid按“否”一选RNAJ每次吸2 pl DEPC先洗3遍,用滤纸弄干用 2 p DEPC 每洗 1 次按 Biank ,MeasureJ洗到 0.5为止每个样品吸2
20、 p,Measure (每测完一次都要擦干)保存(Report )RNA稀释:(mRNA 定量 C统一为200 miRNA 定量C统一为500 )V 力口 DEPCmiRNA 定量(冰上操作、无酶离心管、无酶枪头)取已稀释的RT引物5此加入45山RNA-Free水。准备好96孔板,引物RT, gRT,放在冰上 多配一个体系:miRNA-RT 引物 2 山(n+1 )U6 RT2 讪(n+1 )RNA不少于 1500ng (1500ng/C 统一 =3 山)无菌 ddH 204 讪(n+1 )总体积11讪(n+1 )注意:RT引物用前稀释;配体系时,RT引物和U6RT的量是固定的,模板和水的量是
21、浮动的;只在一个引物里面加内参;下游引物是通用的;不够的体系用无菌ddH 2O配平;做完样品后保存至-20 C;如果接下来要做miRNA定量,则放在4C备用。样品1样品2样品3样品4样品5样品611 M体系 11 M体系 11讪体系 11 M体系 11 M体系 11 pl体系后对应加入模板(1500ng/C统一二)3 p,标记好,放入小型离心机,离心一下,再放入 PCR 仪70 t10min,冰上 2min (程序:000 )放一管无酶tube管,多配一个体系,加入体系:5 x buffer5 p (n+1 )Mix1 p (n+1 )无菌ddH 2O8 讪(n+1 )总体积:14p (n+1
22、 )样品1样品2样品3样品4样品5样品6TTTTT14 p体系14 p体系14 p体系14 p体系14 p体系14 p体系即总体积:25 p42t 1h,371 15min , 98 t 5min (程序:0000 )多配一个体系(n+1 ),混匀,引物瞬时离心:10 p (n+1 )0.8 p (n+1 )0.8 p (n+1 )SYBRFR (通用)ddH 206.4 讪(n+1 )除去模板2山,总体积18讪(n+1 ) 在冰上铺一次性手套,按96孔板在冰里,放好定量小管,标记好 每个小管对应加18山体系,每个样都要有U6作为参照:cDNA123456miRmiR体系miR体系miR体系m
23、iR体系miR体系miR体系U6U6体系U6体系U6体系U6体系U6体系U6体系盖上盖子,注意勿污染,用一次性手套隔着按紧定量管盖子,用镊子轻轻撬松定量小管,离心一 下。去杨老师那,打开Real-time机,桌面miRNA pcrd ,然后OK f Next f选第三个f Open Lid ,放样品,用一次性手套按一下,最后 Close Lid f Star Run,选择文件夹命名好保存,直到机器 绿灯亮起,登记好走人。RT- PCR(冰上操作、无酶离心管、无酶枪头)文档按 1 : 50 比例 力卩 1 pl gDNA Remover 入 50 讪 4 x DNA master mix标记、加
24、样、低速离心,加 2 plRNA进管,RNA热变性5min 65 C,冰上冷却先配总后分装4 x DNA master mix2 p(固定)Vmix总2(n 1)i(根据样品而定)0 5 I,dH2O4讪Vrna C 统一为C统一 |200RNA模板(样品)2 p (W0.5 pg)TotalVdH2O 8-Vmix -Vrna 6-VrnaVdH2O 总 VdH2O (n 137 C 5min冰上冷却注:n为样品数量 上述反应液8山5xRTmixll2 讪Total10 讪37 C 15min , 50 C 5min , 98 C 5min , 4 C 加ddH 20稀释40讪-即稀释5倍(
25、换枪头混匀,4 C保存)保存mRNA定量1、反应体系(冰上操作、无酶离心管、无酶枪头)体系(n+2)*10 (避光)各(n+2) * 0.8(n+2) * 5.42、冰上操作,准备好各种规格的无酶枪头、tube管、引物、定量管3、计算体系,多配2个4、摆好定量管、tube管,标记好,先加体系(加中间,勿碰壁)5、加样一个对应一种引物6、加盖盖紧,离心7、打开Mrd_RT Star Run Open Lid按顺序摆好 Close Lid Star Run 选好文件夹,保存好,开始Western Blot细胞蛋白收样(冰上操作、无酶EP管、无酶枪头)1、 n个样,n*2个EP管(一式两份),实验前
26、2-3分钟准备试剂(RIPA、PI),打冰。2、把要收的样小心吸弃培 养基,注意一组一枪头。3、1ml冷冻的PBS清洗,吸弃,换组换枪头。4、配蛋白裂解液:六孔板 每孔150山十二孔板 每孔100山,多配一点,RIPA: PI=100 : 1 o5、 按体系算好,加入,晃匀,4 C冰箱孵育30min,打开4 C离心机。6、用200山枪头吸匀刮取后加入至tube管,12000x/g (即12000rcf )离心15min7、 移上清至新无酶小管(先吸上部分,下部分 10山枪头慢慢吸,维持140山150山),收样完 后-80 C保存。蛋白浓度测定1、BCA 法(冰上操作、无酶tube管、无酶枪头)
27、BCA试剂:取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。(需先计算体系,即V所需BCA中的B试剂N 样品量 8个标准蛋白曲线孔 )N * 200 ;V 所需 BCA 中的 A 试剂50* N*200 5151标准蛋白质溶液:所买试剂浓度 5mg/ml ,用时稀释成1mg/ml的溶液。(从5mg/ml的标准蛋白溶液吸取12.6讪加入50.4山的RIPA共配63讪的1 口g/讪的标准蛋白溶液)实验操作:绘制标准曲线取96孔酶标板,按下表加入试剂。标准曲线的绘制(表1)管号12345678标准蛋白溶液(卩l)0124812162063讪RIPA (讪)2019181612840BCA试剂(
28、卩l)200200200200200200200200蛋白质浓度(mg/ml) 00.0250.050.10.20.30.40.5上述试剂加完后,准确吸取20山样品(10讪样品+ 10讪RIPA )溶液于酶标孔中,加入BCA试剂200讪,轻摇,于37 C保温30-60min,冷却至室温后,以空白为对照,在酶标仪上590nm处比色-打开酶标仪,把96孔板盖去掉放进酶标仪并合上,电脑打开Gen5,点击BCA.pot ,点OK即可导出Excel。以牛血清白蛋白含量为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照, 根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量-保存Excel文件,选
29、中测得标准蛋白溶液吸光度为横坐标,蛋白质浓度为纵坐标,插入XY散点图,右击表中的散点,添加趋势线,选择多项式,勾选显示公式以及R平均值。将样品吸光值copy成列,将样品测得吸光值带入公式即可求得C所测样品稀释后浓度, 由于所测20讪样品是10山原样品+10山PBS,即稀释2倍,所以C该样品实际浓度=2 XC所测 样品稀释后浓度,n该样品体系最小物质量=C最小所测体系浓度* V最小浓度体积,V所取体积=n该 样 品 体 系 最 小 物 质 量 /C 该 样 品 体 系 浓 度,VSDS=V所取体积/4V补加ripa = V最小体系浓度体积-V所取体积C稀释后最小浓度* V最小浓度体积 V最小体系
30、浓度体积C所测样品稀释后浓度(V最小浓度体积为测得最小浓度的样品剩下体积;C所测样品稀释后浓度为代入公式后的浓度)蛋白变性在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同 体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。上样体积:5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(Loading Buffer )=4:1,离心一下,沸水煮 10分钟,以充分变性蛋白。流程图制胶(1h电泳跑胶(80V 40min 110V 140min& 90V 30min ) 宀转膜(80V 50min&TB
31、ST清洗5次(每次5min )宀封闭(1.5h )宀TBST清洗5次(每次5min )宀附I抗(内参:小鼠抗3 -Actin,先摇床轻摇30min,再放冰箱4度过夜) 宀TBST清洗三次(5min/次附n抗(内参:山羊抗小鼠,轻摇1h TBST清洗三次(5min/次显影物料及配制1、电泳液:一包电泳粉 +1000ml双蒸水(可回收使用)2、10%过硫酸铵:1g过硫酸铵+10ml双蒸水3、转膜液:一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇(可回收使用)4、TBST溶液:50ml 20*TBS+950ml 双蒸水+1ml吐温20。(无需回收)5、封闭液:购买6、I抗(内参):将小鼠抗B -Act
32、in :1稀释液 按1:500稀释待用,4度保存。I抗(目的蛋白58kDa ):将smad2 :I稀释液 按1:1000稀释待用,4度保存。7、n抗(内参):将山羊抗小鼠:n抗稀释液按1:5000稀释代用,4度保存。n抗(目的蛋白58kDa ):将山羊抗兔:n抗稀释液按1:5000稀释待用,4度保存。7、显影液:按说明书配制,避光可长期回收使用&定影液:按说明书配制,可长期回收使用9、发光液:超敏发光液 A液:B液=1:1三、步骤(一)制胶1、 Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 12%分离胶溶液的配制溶液成分成分体积(共约7.2ml )双蒸水2.376ml30%丙烯酰胺溶液2
33、.88ml1.5mol/L Tris ( pH8.8 )1.8ml10%SDS72讪10%过硫酸氨72讪TEMED (最后放,混匀)4讪2、Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 5%积层胶所用溶液溶液成分成分体积(共约4.5ml )双蒸水2.544ml30%丙烯酰胺溶液0.74ml1.5mol/L Tris ( pH6.8 )1.125ml10%SDS45讪10%过硫酸氨45讪TEMED (最后放,混匀)6讪3、1)将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。2)依次将所需试剂加入烧杯中,加入TEMED之后,混匀,用1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的角交替加入分离胶溶液,也可
34、从左到右连续加入(目的:两种方法都可以使液面快速达到水平状态)溶液加至玻璃板约 2/3高度(即插梳子离水平面大约1.5cm ),然后加双蒸水至满或溢出。室温放置约1h,因受温度影响,具体时间以胶凝固并且水平为标准(可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固)如果胶凝固后未达到水平状态,需重做。3 )积层胶溶液的加入同上,使溶液至满或略低,将对应1.00mm 规格的梳子嵌入积层胶溶液(同时按压梳子两侧),室温(25度左右)放置约1h,因受温度影响,具体时间以胶凝固并且水平为标(可 稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固)。注:TEMED的量要严格把握!若配制的胶过早凝固导致液面未达到水平状态,或者长时间不凝固
35、,最可能 的原因是加入TEMED时出现了较大误差。天气较冷时(10度左右),凝固时间会延长,可放恒温箱 中37度加速凝固。(二)跑胶电泳液的配制(凝胶时配好)溶液成分成分体积(共约1200ml )双蒸水1200ml甘氨酸22.56gTris Base3.6gSDS1.2g1、将玻璃板放入电泳槽中,加入适量电泳液(要淹没玻璃板顶部)。在梳子两边同时用力,将其拔出。2、 在积层胶最左侧或最右侧的孔中加入5讪的Mark ,然后在剩余孔中依次加入 30 M蛋白提取液(蓝色)。加入的 Mark和蛋白液的量可适当调整。加入时一定要仔细,视线要与孔保持水平,保证所加蛋白提取液全部落入孔中,否则会影响后期含量测定。3、开始跑胶1) 将电压调为80V,一直至蓝色接近玻璃板底部停止(约40min,分离效果较好)。2)将电压调为80V,当蓝色过了积层胶与分离胶的分界线,可将电压调为110V,一直至蓝色接近玻璃板底部停止(140min,分离效果不如上面方法好)。(三)转膜转膜液的配制(电泳时配好,甲醇转膜前30mi
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