DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析

1、DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析,薄层层析（Thin-layer chromatography,TLC,薄层层析 -是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄膜上铺成薄层作为固定相，以溶剂作为流动相，将样品中各组分分离的方法。 分离原理： 吸附层析,吸附层析的概念及原理,吸附 -一种物质被聚集在另一种物质表面的现象。 吸附剂： -凡是能够将其他物质聚集到本身分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。 被吸附物 -聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附物,吸附层析（Absorption Chromatography,各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,主要

2、是利用吸附剂对不同物质吸附力的不同而达到分离的目的。 薄层层析中吸附剂选择是关键,吸附剂,吸附剂的选择,1）应不溶于所使用的溶剂;与所使用的溶剂和样品中各组分不起化学反应； （2）应具有较大的吸附表面（吸附容量）和一定的吸附力;对被分离个组分有不同的吸附力,有足够的分辨力； （3）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的重复性,吸附剂的吸附能力,常称为活度，用罗马字母、表示。 活度 强 弱 含水量 多 少,常用吸附剂,极性： 硅胶: 为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸性及中性物质。 氧化铝: 氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点 碱性/中性/酸性氧化铝 非极性： 纤维素 聚酰胺： 合成：己二

3、酸、己二胺 特点：氢键吸附剂,是类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成,因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺,聚酰胺,是由于聚酰胺的-CO(羰基)及NH(氨基)能与被分离物质之间形成氢键。 如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类（如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键 如硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键 被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。 在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离,

4、聚酰胺对极性物质的吸附作用,溶剂,不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大小各种溶剂的洗脱能力各不相同。 一般所选溶剂要求： a.纯度合格 b.黏度要小易与样品中各组分相分离 c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应,溶剂选择考虑因素,1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力 2、溶剂与样品之间的作用因素 溶剂的选择可通过实验来确定,薄层层析的操作,1、点样 样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶剂挥发后反复进行至点完为止。 样品原点直径3mm,2.平衡 3.展开 方法： 上行层析法 下行层析法 双向展开法,显色,1）有色物质（如黄体酮）展开后即可显出斑点 2）紫外灯下

5、显出荧光斑点，如核苷酸和某些生物碱 3）显色剂显色,荧光试剂 DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯 蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基结合 DNS-aa发出黄绿色荧光,DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即,在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2，即,DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光 DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光 可彼此区分,三、薄层层析的应用,一）定性分析：将已知化合物作为标准品与样品一起进行层析后对照，可初步确定未知化合物的组成。 （二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须破坏薄层； 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱，再用其他方法测定,临床生化上的应用,

6、1.氨基酸的分离 2.核苷、核苷酸和核酸的分析,DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析,二甲氨基萘磺酰氯 (1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride，DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。 形成的DNS-氨基酸在紫外线（260nm或365nm）照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测DNS-氨基酸的存在,pH9.8,40,30min,本实验中，聚酰胺上胺基与氨基酸的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与AA中羟基或酚基形成氢键。由于有些AA结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到完全分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向

7、层析。 第一向苯冰醋酸 第二向甲酸水,二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄绿色荧光。 DNS-Cl + AA DNS-AA + HCl,反应的副产物：DNS-NH2黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光,显色,DNS-氨基酸的双向层析图谱,1、DNS氨基酸的制备 2、混合DNS氨基酸的双向层析 （1）点样。距右下角距两边各0.5cm，直径控制在23mm之间，点在无光泽面,可重复几次点样。 （2）苯冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端3mm处即可停止,冷风吹干，紫外观察。 （3）甲酸水层析：调转90度与第一相垂直，热风吹干，紫外灯下观察

8、，用铅笔轻轻标记,操作以及注意事项,1）严格控制点样位置以及点样直径。 （2）展层时勿将点样浸入溶剂系统。 （3）展层后必须经电吹风将膜吹干。 （4）使用紫外照射时要注意使用时间短,注意,Procedure for TLC,1. Prepare the developing container. The developing container for TLC can be a specially designed chamber, a jar with a lid, or a beaker with a watch glass on the top,Pour solvent into the

9、 beaker to a depth of just less than 0.5 cm,To aid in the saturation of the TLC chamber with solvent vapors, line part of the inside of the beaker with filter paper,Cover the beaker with a watch glass, swirl it gently, and allow it to stand while you prepare your TLC plate,TLC plates used in the org

10、anic chem teaching labs are purchased as 5 cm x 20 cm sheets. Each large sheet is cut horizontally into plates which are 5 cm tall by various widths; the more samples you plan to run on a plate, the wider it needs to be,Prepare the TLC plate,Shown in the photo to the left is a box of TLC plates, a l

11、arge un-cut TLC sheet, and a small TLC plate which has been cut to a convenient size. Plates will usually be cut and ready for you when you come to lab,Handle the plates carefully so that you do not disturb the coating of adsorbent or get them dirty,Measure 0.5 cm from the bottom of the plate. Take

12、care not to press so hard with the pencil that you disturb the adsorbent,Using a pencil, draw a line across the plate at the 0.5 cm mark. This is the origin: the line on which you will spot the plate,Its kind of hard to see the pencil line in the above photos, so here is a close-up of how the plate

13、looks after the line has been drawn,Under the line, mark lightly the name of the samples you will spot on the plate, or mark numbers for time points. Leave enough space between the samples so that they do not run together, about 4 samples on a 5 cm wide plate is advised. Use a pencil and do not pres

14、s down so hard that you disturb the surface of the plate. A close-up of a plate labeled 1 2 3 is shown to the right,Spot the TLC plate,. . swirl until dissolved,add a few drops of solvent . .,dip the microcap into solution - the arrow points to the microcap, it is tiny and hard to see,make sure it i

15、s filled - hold it up to the light if necessary,touch the filled microcap to TLC plate to spot it - make sure you watch to see that all the liquid has drained from the microcap,rinse the microcap with clean solvent by first filling it . .,. . and then draining it by touching it to a paper towel,here

16、s the TLC plate, spotted and ready to be developed,Develop the plate,place the TLC plate in the developing container - make sure the solvent is not too deep,The solvent will rise up the TLC plate by capillary action. In this photo, it is not quite halfway up the plate,In this photo, it is about 3/4

17、of the way up the plate,Remove the plate from the beaker,quickly mark a line across the plate at the solvent front with a pencil,Allow the solvent to evaporate completely from the plate. If the spots are colored, simply mark them with a pencil,Visualize the spots,Most samples are not colored and nee

18、d to be visualized with a UV lamp. Hold a UV lamp over the plate and mark any spots which you see lightly with a pencil,this is a UV lamp,here are two proper sized spots, viewed under a UV lamp (you would circle these while viewing them,The plate shows three compounds run at three different concentrations. Th