蚕用消毒剂药效评价试验技术指导原则

1、蚕用消毒剂药效评价试验技术指导原则一、概述（一）定义与目的 蚕用消毒剂药效评价试验技术指导原则是为蚕用消毒剂进行临床试验制定 的。蚕用消毒剂临床消毒效果评价以家蚕为主要对象， 其目的是为了评价一种蚕 用消毒剂是否对家蚕病原微生物具有消毒 （杀灭） 作用，并确定临床应用的推荐 用法与用量。 广谱蚕用消毒剂必须对本指导原则中列出的所有菌、 毒种进行消毒 试验，专用消毒剂可选择 1 种或几种菌、毒种进行试验。（二）适用范围本指导原则适用于蚕室蚕具消毒剂、 蚕用烟熏剂和桑叶叶面消毒剂对各种病 原体的消毒效果评价。二、试验设计（一）试验用蚕1. 品种：用一化性或二化性的现行普通四眠蚕品种，所用蚕种为杂交

2、种。2. 来源：有生产许可证单位生产的合格蚕种。（二）试验材料1. 受试药物及来源 ：受试药物应与拟上市的制剂完全一致，有完整的产品质 量标准，有合乎规定格式的说明书。 受试药物应来源于同一批号， 由申报单位自 行研制并在GMP佥收合格的车间生产的样品，并提供中国兽医药品监察所或农业 部认定的其他兽药检验机构出具的产品检验合格报告。2. 标准培养基 ：下列标准培养基和稀释液用于试验菌、毒种的制备。 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、稀释液（胰蛋白胨生理盐水溶液） 、沙堡液体培养基、沙堡琼脂培养基、有机干扰物（ 3%牛血清白蛋白）。上述培养基配方参见附录 A 。3. 试验菌、毒种应采用大学或省级以

3、上专业研究机构鉴定保藏的菌种。如果采用自然感染病例分离的菌株， 应详细记录其来源， 并应经有资质的部 门鉴定方可用于试验。试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备等见附录B。（三）残留消毒剂的去除和中和剂选择观察药物的杀菌 （消毒）作用时， 必须在药物与菌体接触一定时间后立即去 除菌体周围的药物或消除药物的杀菌作用。 去除残留消毒剂的方法可用化学中和 法和离心沉淀法等。1.化学中和法是目前最常用的一种方法。 做法是向标本回收液中加入适当量的中和剂， 使 消毒剂浓度得到稀释，并且消毒作用受到化学中和。中和剂选择试验方法见附录 C。2.离心沉淀法将消毒处理后的标本用磷酸盐缓冲液反复离心洗涤

4、3 次，最后将沉淀物转种 到合适培 养基 上进行培养。无论用何种方法，事先必须用实验证明该法可中止消毒剂的作用且对实验 菌、毒种无抑制作用，对培养基无不良影响。（四）试验分组进行蚕用消毒剂试验时应分以下各组。1. 空白对照（不感染不处理）组。2.感染不处理组（阴性对照组） ：根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒 剂溶液，按试验组同样的方法进行试验。 所得结果代表菌液原有浓度， 以其作为 计算杀灭对数或灭活率的初始浓度。3. 试验组：根据本原则中所列试验菌、毒种，选定所有的试验菌种和不同消 毒剂浓度以及作用时间进行试验； 如试验目的是研制专用的蚕用消毒剂， 根据本 原则中所列试验菌、 毒种， 选

5、定相应的试验菌、 毒种和不同消毒剂浓度以及作用 时间进行试验。4. 药物对照组（阳性对照组） 。每个组设 3 个重复，每个重复（单元）用 50 条 2 龄起蚕。五）试验方法蚕用消毒剂进行消毒试验时， 常用的试验方法有： 悬液定量杀灭试验、 载体 浸泡定量杀灭试验、 载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验等。 进行蚕室蚕 具消毒剂研制时， 一般采用悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验； 或追加 载体喷雾定量杀灭试验；进行烟熏剂研制时，采用烟熏定量杀灭试验。1. 细菌芽孢消毒试验进行细菌芽孢消毒试验时，有下列 4 种方法可供选择，按测试目的选择 1 种方法进行试验。（1）悬液定量杀灭试验操作程序

6、 消毒液配制：首先按试验设计或产品说明书要求配制消毒液。 无特殊说明者， 一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的 1.25 倍（例如要评价的消毒 液浓度为200 mg/L,则应配制250mg/L）,置20CC 水浴备用。试验菌液配制：按照 “附录 B 试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片 的制备”规定的方法配制实验用菌悬液，浓度为1xi08cfu/ml5X108cfu/ml。消毒处理：取消毒试验用无菌大试管,先加入 0.5ml 试验用菌悬液,再加入0.5ml有机干扰物，混匀，置 20CC水浴中5min后，用无菌吸管吸取上述 浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。中和

7、：待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5ml 试验菌与 消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。活菌计数：各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸 取 1.0ml 样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数， 每管样液作两次活菌计数即 可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列 10倍稀释后，再进行活菌培养 计数。对照：同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性 对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。培养与观察：所有试验样本均在 37C温箱中培养，培养72h观察最终结 果。重复与计量：试验重复 3 次，计算各组的活菌浓度（ c

8、fu/ml） ，并换算为对 数值（N）,然后按下式计算杀灭对数值：杀灭对数值（KL ）=对照组平均活菌浓度的对数值（No）-试验组活菌浓计算杀灭对数值时， 取小数点后两位值， 可以进行数字修约。 如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数， 小于等于 1 时，其杀灭对数值， 即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值。度对数值（ Nx）（2）载体浸泡定量杀灭试验操作程序 消毒处理：取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量， 吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。将盛有消毒剂的平皿置 20CC温箱 内 5 min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液 中。中

9、和与活菌计数： 待菌药相互作用至各预定时间， 用无菌镊子将菌片取出分 别移入一含5.0ml中和剂试管中。用电动混合器混合20s,或将试管在手掌上振 敲80次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置 5 min以上，使中和作 用充分。 最终进一步混匀后, 吸取 1.0 ml 直接接种平皿, 每管作两次活菌计数, 测定存活菌数。对照：另取无菌小平皿， 按每片 5.0ml 的量，吸取相应的稀释液注入平皿中， 置20CC温箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3片，并 使之浸透于稀释液中，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组） 。以不 作任何处理的作为空白对照组。培养与观察：所有试

10、验样本均在 37C温箱中培养，培养72h观察最终结 果。重复与计量：试验重复 3次（包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片）， 并换算为对数值（N），然后按 悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。（ 3）载体喷雾定量杀灭试验操作程序 选定消毒剂的浓度与作用时间：根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定 1 个消毒剂浓度（试验设计中设定的浓度）和至少 3 个不同作用时间进行 试验。载体设置： 试验时， 每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列， 均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内） 。消毒处理：每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。

11、每次喷雾的距离和压力保持一致， 以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一 致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。中和与活菌计数： 待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间， 取每种载体菌 片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合 20s,或在手掌上振敲80次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。吸取1.0ml上 述洗脱液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管作两次活菌计数。每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。 喷雾器换装新浓 度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。对照：用稀释液代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，进行平行试验， 作为感染

12、不处理组（阴性对照组） 。以不作任何处理的作为空白对照组。培养与观察：所有试验样本均在 37C温箱中培养，培养72h观察最终结 果。重复与计量：试验重复 3次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数 值（N）,然后按 悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。（ 4）烟熏定量杀灭试验操作程序根据试验设计或产品说明书的要求， 选定试验菌种与消毒剂的浓度和作用时 间进行试验。熏烟容器：烟熏定量杀灭试验在一个容积为 1m3正方形的密闭箱子内进行， 箱子的每个内壁都安装有宽约20cm的平台，分三层，供消毒时放置菌片用。如 需要特定的温度条件， 试验时箱子内的温度必须达到要求的温度。 试验时， 每

13、种 载体菌片各取 12片，分上、中、下三层放置，每片菌片放置在一清洁无菌玻璃 板上（如无菌平皿内） ，每层 4 片菌片，分别放在不同的平台上。消毒处理：每批试验根据试验设计的要求进行， 如该产品注明必须利用烟雾 进行消毒，要做到消毒时无明火，且药剂发烟充分彻底。中和与活菌计数： 待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间， 打开箱子， 分 别从每层取载体菌片 1 片（共 3 片），一起放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管 中。将试管用电动混合器混合20s,或在手掌上振敲80次，使菌片上细菌被洗 脱进入中和液中。吸取 1.0ml 上述洗脱液，按活菌培养计数方法测定存活菌数， 每管作两次活菌计数。对照

14、：在相同的温度下将菌片放置在不作消毒处理的箱子内相同时间， 进行 平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组） 。以不作任何处理的作为空白对照 组。培养与观察：所有试验样本均在 37C温箱中培养，培养72h观察最终结 果。重复与计量：试验重复 3次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数 值（N）,然后按 悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。（ 5）评价规定产品申报新蚕用消毒剂时，要求在产品说明书指定的浓度与 3个作用时间， 重复试验 3 次。在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的 1.5 倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均应5.00要求载体浸泡定量杀灭试验、载

15、体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验中， 各次的杀灭对数均应 3.00可判定为消毒合格。在产品指定浓度与最短作用时间的 0.5倍时，可容许 在部分重复次数中，出现不合格结果。产品鉴定时，在产品说明书指定的最低浓度与最低作用时间，重复试验 3 次。要求悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均 5.00可判定为消毒合格。 要求载体浸泡定量杀灭试验、 载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验中， 各 次的杀灭对数值均3.00可判定消毒合格。报告中应将各次试验的结果全部以表格的形式列出。 感染不处理组（阴性对 照组）应列出各次试验菌浓度， 以及平均试验菌浓度。 试验组应列出杀灭对数值， 杀灭对数值大于5.

16、00时，应表示为 5.00而不必列出具体的数字；杀灭对数值 小于 5.00时，应列出具体的数字（例如 2.58，4.65）。（ 6 ）注意事项试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查， 发现有菌生长， 则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。悬液定量杀灭试验时，有机干扰物一般采用 3% （W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取 0.5ml加入 到消毒体系中（稀释 10倍），进行消毒试验。如果某消毒剂使用说明书中规定， 产品只用于清洁物品或器械的消毒或只作清洗消毒，可采用0.3% （W/V ）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。进行烟熏

17、定量杀灭试验时要密切观察，防止明火产生，注意安全。2. 真菌消毒试验（1）试验程序常用杀灭试验有： 悬液定量杀灭试验、 载体浸泡定量杀灭试验、 载体喷雾定 量杀灭试验、 烟熏定量杀灭试验等。 选择的试验菌种一般为白僵菌和黄曲霉， 试 验用培养基一般为沙堡琼脂培养基和沙堡液体培养基。其操作程序同 “细菌芽孢 消毒试验 ”。活菌培养计数时，对白僵菌，在25C培养箱中培养24h72h观察最终结果。 对黄曲霉，在30C培养箱中培养24h72h观察最终结果。（2）评价规定和注意事项与“（五） 1（ 5）细菌芽孢消毒试验 ”相同。3. 病毒消毒试验常用杀灭试验方法有悬液定量杀灭试验、 载体浸泡定量杀灭试验

18、、 载体喷雾 定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验等，按测试目的选择 1 种方法进行。（1）悬液定量杀灭试验操作程序消毒液配制： 按试验设计要求配制消毒液。 无特殊说明者， 一律使用无菌硬 水配制，配制的浓度为待测浓度的 1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为 200 mg/L， 则应配制250mg/L），置20CC水浴备用。病毒液配制：按照 “附录 B 试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的 制备”中规定的方法配制实验用家蚕核型多角体病毒多角体或质型多角体病毒多 角体悬液，浓度为1X109个/ml。消毒处理：取消毒试验用无菌大试管， 先加入 0.5ml 试验用病毒多角体悬液， 再加入0.5ml有

19、机干扰物，混匀，置 20C C水浴中5min后，用无菌吸管吸 取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。中和：待试验病毒多角体与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5ml 试验病毒与消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。添食：各管试验病毒与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，将中和后 的混合液均匀地涂抹于直径 2cm 的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹 50 l 混合液， 每区（单元） 50 头 2 龄起蚕，每区（单元）喂饲涂抹混合液的圆叶 6 片，每种核型多角体病5d,质型多角体病10d，期间出现病死蚕应及时调查确认），饲养过程中随时观察蚕体的生长

20、发育情况，做好病蚕的隔离消毒工作，防止交叉感染。根据各种病的发病症状并结合显微镜进行逐条检查，记录发病蚕头数。计算各组发病率，然后按下式计算灭活率：处理设3个重复核型多角体病5d，质型多角体病10d，期间出现病死蚕应及时调查确认），饲养 过程中随时观察蚕体的生长发育情况，做好病蚕的隔离消毒工作，防止交叉感染。 根据各种病的发病症状并结合显微镜进行逐条检查，记录发病蚕头数。计算各组 发病率，然后按下式计算灭活率：阴性对照组发病率试验组发病率阴性对照组发病率100%重复：试验重复3次，计算平均灭活率。（2）载体浸泡定量杀灭试验操作程序消毒处理：取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片5.0ml

21、的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。将盛有消毒剂的平皿置 20CC温箱 内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片3片，并使之浸透于消毒液中。中和与添食：待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移 入一含5.0ml中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的病毒被洗脱进入中和液中， 再放置5min以上，使中和作用充分。 最终进一步混匀后，将中和后的混合液均匀地涂抹于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹50 l混合液，每区（单元）50头2龄起蚕，每区（单元）喂饲涂 抹混合液的圆叶6片，每种处理设3个重复。对照：另取无菌小平皿，按每片5.

22、0ml的量，吸取相应的稀释液注入平皿中， 置20CC温箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3片，并 使之浸透于稀释液中，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。饲养管理、观察与计量：待蚕将以上涂抹混合液的桑叶食尽后， 改喂普通无 菌桑叶。根据各种蚕病潜伏期的长短，在2527 C下饲养观察一定时间（一般阴性对照组发病率试验组发病率阴性对照组发病率100%重复：试验重复3次，计算平均灭活率。（3）载体喷雾定量杀灭试验操作程序选定消毒剂的浓度与作用时间：根据所试病毒和消毒剂对该病毒的杀灭能 力，选定1个消毒剂浓度（试验设计中设定的浓度）和 至少3个

23、不同作用时间 进行试验。载体设置：每种病毒所染菌片应分开进行试验。 试验时，每种载体菌片各取 3片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌 玻璃板上（如无菌平皿内）。消毒处理：每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷 雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一 致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。中和与添食：待试验菌片与消毒剂相互作用至各规定时间， 取每种载体菌片 1片，各放入一含5.0ml中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合 20s， 或在手掌上振敲80次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。 将中和后的混合液 均匀地涂抹

24、于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹 50 l混合液，每区（单 元）50头2龄起蚕，喂饲涂抹混合液的圆叶 6片，重复3区（单元）。待蚕将以 上涂抹混合液的桑叶食尽后，改喂普通无菌桑叶。消毒处理注意事项：每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃 板。喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。对照：用稀释液代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，进行平行试验， 作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照组。饲养管理、观察与计量：根据各种蚕病潜伏期的长短，在2527C下饲养观察一定时间（一般核型多角体病5d，质型多角体病10d，期间出现病死蚕应及

25、阴性对照组发病率试验组发病率阴性对照组发病率100%重复：试验重复3次，计算平均灭活率。（4）烟熏定量杀灭试验操作程序根据试验设计，选定试验病毒与消毒剂的浓度和作用时间进行试验。消毒容器与消毒处理：烟熏定量杀灭试验在一个容积为1m3正方形的密闭箱 子内进行，箱子的每个内壁都安装有宽约 20cm的平台，分三层，供消毒时放置 菌片用。如需要特定的温度条件，试验时箱子内的温度必须达到要求的温度。 每 种病毒所染菌片应分别在不同的箱子内进行试验。 试验时，每种载体菌片各取12 片，分上、中、下三层放置，每片菌片放置在一清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿 内），每层4片菌片，分别放在不同的平台上。每批试验根据

26、试验设计或产品说明书的要求进行，如该产品注明必须利用烟雾进行消毒，要做到消毒时无明火，且药剂发烟充分彻底。中和与添食：待试验菌片与消毒剂相互作用至各规定时间， 打开箱子，分别 从每层取载体菌片1片（共3片），一起放入一含5.0ml中和剂的无菌试管中。 将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，使菌片上病毒被洗脱进 入中和液中。各管试验病毒与消毒剂混合液经加中和剂作用10mi n后，将中和后的混合液均匀地涂抹于直径2cm的圆形桑叶背面，每片圆叶涂抹50 l混合液，每区（单 元）50头2龄起蚕，每区（单元）喂饲涂抹混合液的圆叶6片，每种处理设3个重复。对照：在相同的温度下将菌片放置在不作

27、消毒处理的箱子内相同时间，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。以不作任何处理的作为空白对照 组。饲养管理、观察与计量：待蚕将以上涂抹混合液的桑叶食尽后， 改喂普通无 菌桑叶。根据各种蚕病潜伏期的长短，在2527 C下饲养观察一定时间（一般阴性对照组发病率试验组发病率阴性对照组发病率100%重复：试验重复3次，计算平均灭活率。（5）评价规定病毒消毒试验，可用于评价消毒剂对家蚕病毒的灭活效果。感染不处理组（阴性对照组）的发病率 95.0%3次试验的平均灭活率99.0%，可判为对家蚕病毒消毒合格。（6）注意事项试验操作时尽量使用移液器与无菌一次性吸头。饲养观察过程中必须做好病蚕隔离消毒工作

28、，防止二次感染。进行烟熏定量杀灭试验时要密切观察， 防止明火产生，注意安全。4. 微抱子虫消毒试验常用杀灭试验方法有：悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷 雾定量杀灭试验、烟熏定量杀灭试验等。根据测试目的选择其中1种方法进行试 验，4种方法的操作程序同3.病毒消毒试验”。使用2龄起蚕进行试验，消毒接 种蚕体后饲养观察时间为9d，饥饿1d。评价规定和注意事项同3.病毒消毒试验”。三、试验报告为公正、科学地评价药物消毒效果，对试验报告内容做如下要求：1. 试验目的。2. 试验家蚕应注明品种、龄期。3. 试验时间与地点。4. 试验设计者、负责人、参加者及电子邮箱。5. 对照药物需注明蚕药名

29、称、生产厂家、规格、生产批号及用法与用量 受试药物需注明蚕药名称、生产厂家、规格、生产日期及生产批号等。6. 试验数据，应有详细的试验原始记录。原始资料保存处、联系人、电话。7. 用于消毒试验的病原微生物需注明其来源、名称、菌液制备方法、攻毒 方法、剂量。8. 归纳总结药物的消毒效果，确定受试药物的用途、推荐剂量、给药次数 和给药间隔等。9. 试验单位（加盖公章） 。附录 A 消毒试验用试剂和培养基配方1. 磷酸盐缓冲液 （PBS， 0.03mol/L，pH7.2）无水磷酸氢二钠2.83g磷酸二氢钾1.36g蒸馏水加至1000ml将各成分加入到1000ml蒸馏水中，待完全溶解后，调pH 至7.

30、27.4,于121C压力蒸气灭菌20min备用。2. 有机干扰物牛血清白蛋白30g蒸馏水1000ml溶解后用微孔滤膜（孔径为0.45 m滤过除菌，冰葙保存备用。3. 营养琼脂培养基蛋白胨10g牛肉膏5g氯化钠5g琼脂15g蒸馏水1000ml除琼脂外其他成份溶解于蒸馏水中，调 pH 至 7.27.4，加入琼脂，加 热溶解，分装，于121C压力蒸汽灭菌20min备用。4. 营养肉汤培养基蛋白胨10g牛肉膏5g氯化钠5g蒸馏水1000ml将各成分溶解于蒸馏水中，调pH至7.27.4,分装，于121C压力蒸汽灭菌 20min 备用。5. 稀释液：胰蛋白胨生理盐水溶液（ TPS）胰蛋白胨1.0g氯化钠8

31、.5g先用 900ml 以上蒸馏水溶解，并调节 pH 值在 7.00.2，最终用蒸馏水加至1000ml，分装后，经121C压力蒸汽灭菌后使用。6. 沙堡琼脂培养基葡萄糖40g蛋白胨10g琼脂20g蒸馏水1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH至5.6 .2，于115C压力蒸汽灭菌 30min 备用。7. 沙堡液体培养基葡萄糖蛋白胨蒸馏水40g10g1000ml将上述成分混合后，加热至完全溶解，调pH至5.6 .2，于115C压力蒸汽灭菌 30min 备用。附录 B 试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备试验菌、毒种有：苏芸金芽孢杆菌卒倒亚种 ( Bacillus thuri

32、ngiensis subsp . sottoIshiwata)芽抱、球抱白僵菌 Beauveria bassiana ( Bals.) Vuill.和黄曲霉( Aspergillus flavus Link )、 家蚕核型 多角体病毒 ( Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)多角体病毒和家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus, BmCPV)多角体病毒、家蚕微抱子虫(Nosema bombycisNaegeli) 抱子。1. 细菌芽抱悬液的制备、计数及保藏( 1 )细菌芽抱悬

33、液的制备冻干保藏的细菌芽抱： 制备芽抱悬液时， 开封冻干保藏的安瓿后， 悬浮于少 许营养肉汤中，吸出少量菌液接种营养肉汤，于37C，培养24h;在营养琼脂平板上划线培养，37C，培养24h，挑取典型菌落接种营养肉汤，37C培养24h, 吸取培养物接种罗氏瓶内琼脂表面，或中管琼脂斜面表面，37C培养5d7d，于室温放置3d5d (亦可不放)，取少许菌苔作芽抱染色，镜检。当每个视野内 的芽抱数达 90 95%以上时，用无菌生理盐水洗下菌苔(用 L 形玻璃棒刮)，无 菌过滤菌液，注入有玻璃球的无菌瓶中，用手充分振荡，3000r/min离心10min, 如此反复 3 次，将菌液悬浮于无菌生理盐水中，制

34、成适当浓度的菌液，于45C水浴24h，再80C水浴10min,放置4C冰箱保存备用。( 2)活菌计数 稀释：先将菌液用比浊法或分光光度计测定法初步估测菌液含菌浓度， 然后 用培养基作 1 0倍系列稀释。接种：吸取0.1ml菌液于合适的固体培养基平皿内。每个稀释度接种3个平皿，接23个稀释度。将平皿上菌液摇匀后，置 37C培养。计数：选每个平皿菌落数在 30300个者计数(未稀释的原液不足 30者亦 应计数）。将计数结果换算成每毫升原液的菌落数， 并计算该稀释度的平均菌数。 平板间或稀释度间的误差率超过 10%应重做。计数好的细菌芽抱悬液放置4C冰箱保存，有效期为3个月。（3）细菌芽孢的保藏 细

35、菌芽抱可用冻干保藏法和定期移植保藏法等方法进行保藏。冻干保藏法可保藏细菌芽抱 10 年。用定期移植法保藏细菌芽抱时，在营养 琼脂培养基上移植培养，移植次数不超过 5次，移植培养好后放置于4C冰箱内 保藏，每次保藏不超过 6个月，移植次数超过 5次时， 必须在蚕体上进行接种复 壮后才能继续使用。2. 白僵菌分生抱子悬液的制备、计数及保藏（1）繁殖与培养物获取取定期移植保藏的菌种管， 在无菌操作下打开， 挑取少些分生抱子， 接种于 沙堡琼脂斜面上，于25 C培养5d7d,即得到白僵菌分生抱子新鲜培养物。 取新鲜培养的菌种管一支，用 5.0 ml吸管吸取3.0 ml5.0ml稀释液加入斜面 试管内，

36、反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管 中，加入少量的橡皮颗粒（可用普通橡皮自制），用电动混合器混合 20s，或在 手掌上振敲 80次，以使分生抱子悬浮均匀。（ 2）剔除菌丝与其它杂物用滤过法除去菌丝。滤过后，显微镜下（ 400-640倍）观察是否存在菌丝， 若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min6000 r/min，离心20min。再次在显微 镜下观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰氏染色与生化试验等法进行鉴定。（ 3）分生抱子液储存白僵菌分生抱子悬液在 4C 储存，当天使用，不得过夜。（ 4）分生抱子液配制使用时，可用

37、稀释液适当稀释。悬液试验时菌悬液的含菌量为1 X107 cfu/ml 5X107 cfu/ml。菌悬液的含菌量按活菌计数的要求进行。（ 5）制备染菌样片制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10卩。染菌后，置室温下 自然阴干后再使用。（6）菌物回收回收菌数应达5X105cfu/片5X106cfu/片，也可依试验要求确定。（ 7）试验菌种保存用定期移植法保藏白僵菌菌种。 在沙堡琼脂培养基上移植培养， 移植次数不 超过5次，移植培养好后放置于4C冰箱内保藏，每次保藏不超过 3个月，移植 次数超过 5 次时，必须在蚕体上进行接种复壮后才能继续使用。3. 黄曲霉分生孢子悬液的制备、计数及保藏（

38、1 ）繁殖与培养物获取取定期移植保藏的菌种管， 在无菌操作下打开， 挑取少些分生孢子， 接种于 沙堡琼脂斜面上，于 30C培养5d7d,即得到黄曲霉分生抱子新鲜培养物。 取新鲜培养的菌种管一支，用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml 5.0ml 稀释液加入斜面 试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管 中，加入少量的橡皮颗粒，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使分生抱子悬浮均匀。（2）剔除菌丝与其它杂物要求同 2.（ 2）白僵菌。（3）分生抱子液储存黄曲霉分生抱子悬液在4C储存，储存不能超过2 d,使用前，混合均匀， 在显微镜下观察是否有抱子

39、出芽，若有抱子出芽，则弃之不用。（4）分生抱子液配制要求同 2.（ 4）白僵菌。（5）制备染菌样片要求同 2.（ 5）白僵菌。（6）菌物回收要求同 2.（ 6）白僵菌。（7）试验菌种保存要求同 2.（ 7）白僵菌。4. 家蚕核型多角体病毒多角体的制备、计数及保藏（1）家蚕核型多角体病毒多角体的制备将家蚕核型多角体病毒多角体用蒸馏水配成1X106个/ml浓度的多角体悬液涂抹在桑叶上，给4龄起蚕添食8h左右，接种病毒后的蚕用清洁桑叶在2425C 的温度下饲养， 饲养至 5 龄蚕充分发病时， 用剪刀剪破病蚕的腹足和尾角， 收集 病蚕体液。收集的体液3000 r/min离心10min,离心后取沉淀物，

40、将沉淀用生理 盐水充分悬浮， 300r/min 离心 3min ，取上清，反复差速离心多次，直至基本无 杂质为止。将纯净的多角体用无菌生理盐水悬浮，制成多角体悬液。（2）家蚕核型多角体病毒多角体的计数用血球计数板进行计数，计数好的悬液用无菌生理盐水调成1X109个/ml的多角体悬液，置4C冰箱内备用。（3）家蚕核型多角体病毒多角体的保藏置4C冰箱内保藏，有效使用期为 6个月。5. 家蚕质型多角体病毒多角体的制备、计数及保藏（1）家蚕质型多角体病毒多角体的制备将家蚕质型多角体病毒多角体用蒸馏水配成1 X106个/ml浓度的多角体悬液涂抹在桑叶上，给2 龄起蚕添食 8h 左右，接种病毒后的蚕用清洁

41、桑叶在 2527C 的温度下饲养，饲养至4 5龄蚕充分发病时，解剖病蚕，收集病蚕中肠。收集 的病蚕中肠先研磨，用纱布过滤，去除大的中肠组织碎片，然后以300 r/min、3min 与 3000 r/min、10 min 进行差速离心， 离心后去除沉淀物中上、 下层的杂质， 反复离心多次， 直至基本无杂质为止。 将纯净的多角体用无菌生理盐水悬浮， 制 成多角体悬液。（2）家蚕质型多角体病毒多角体的计数用血球计数板进行计数，计数好的悬液用无菌生理盐水调成1X109个/ml的多角体悬液，置4C冰箱内备用。（3）家蚕质型多角体病毒多角体的保藏置4C冰箱内保藏，有效使用期为 6个月。6. 家蚕微孢子虫孢

42、子的制备、计数和保藏（1）家蚕微孢子虫孢子的制备将家蚕微抱子虫抱子用生理盐水配成 1 X1041 X05个/ml浓度的抱子悬液涂 抹在桑叶上，给2龄起蚕添食8h左右，接种抱子后的蚕用清洁桑叶在 2527C 的温度下饲养， 饲养至蚕充分发病时， 解剖病蚕，收集已病变的丝腺和中肠组织， 或收集病蛾。 收集的病蚕组织或病蛾先充分研磨， 用纱布或其它滤网、 装置等过 滤，去除组织碎片。然后以 500 r/min、 5 min 与 3000 r/min、10 min 进行差速离 心，离心后去除沉淀物中上、下层的杂质，反复差速离心多次，直至基本无杂质 为止。将纯净的抱子用无菌水悬浮，制成抱子悬液。（2）家蚕微抱子虫抱子的计数用血球计数板进行计数，计数好的悬液用无菌水调成1X109个/ml的抱子悬液，置4 C冰箱内备用。（3）家蚕微抱子虫抱子的保藏置4C冰箱内保藏，有效使用期为 6个月。7. 试验菌片的制备为了测定消毒剂或消毒方法对不同物品上微生物的杀灭作用， 常用代表性的 材料制备染菌样片，比较常用的有布片、铝片、玻璃片、纸片、竹片等。试验前 应将材料制成 0.5 X1.0cm2 或 1X1cm2、1.5X1.5cm2 的样片，用洗衣粉煮沸后用自 来水冲洗、晾干、经高压灭