分子生物学实验理论考试

1、.2012-2013学年第二学期分子生物实验考试题库1、 PCR原理是什么？答：PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。双链DNA是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子（变性），两引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，在引物的引导下，按53方向复制互补DNA，即引物的延伸。在适宜的条件下，这种热变性复性延伸的过程不断循环重复，前一个循环的产物DNA可作为后一个循环的模板DNA参与DNA合成

2、，使产物DNA的量按2n方式扩增。2、 PCR一般体系应加入哪些试剂？答：10*PCR缓冲液（含Mg+）、模板DNA、四种dNTP、一对引物、耐热Taq聚合酶。3、 PCR防止其它DNA污染，应注意哪些问题？答：标本放置时密封要严避免溢于容器外，容器要清洁避免造成相互间交叉污染；移液器使用要规范避免污标本间污染;无菌工作台操作，避免气体中有杂菌。4、 影响PCR产物产量的因素主要有哪些？答：引物、酶的种类及浓度、dNTP的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯化程度、Mg2+浓度、温度与时间、循环次数。5、 引物设计应注意哪些问题？答：引物长度不宜过长20bp左右较佳；引物扩增片段的长度以200

3、-500为宜；引物碱基的中G+C的含量应在40-60%为宜，G+C太少则扩增效果不佳，G+C过多则易出现非特异条带；避免引物内部出现二级结构，避免两天引物间互补，特别是3端的互补否则会形成二聚体结构；引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6、 简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤？答：克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技术对基因进行大量扩增，首先准备好实验材料大体为：需扩增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR缓冲液、引物等、其过程大体分为3个步骤：第一步：变形：通过加热使DNA模板双螺旋链解离为单链，第二步：退火

4、：当温度突然降低时。由于模板DNA结构复杂难再互补，而引物建构简单且数量巨多易于模板DNA互补杂交从而使引物结合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四种底物及镁离子存在条件下DNA连开始延伸。以上3个步骤为一个循环，数小时后即可得到大量扩增的目的片段。7、 什么是质粒？质粒的基本性质有哪些？答：a质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。b具有复制起点。携带易于筛选的选择标记。具有多种限制性内切酶的切割位点

5、。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。8、 质粒抽提实验中溶液I、II、III各有什么作用？答：溶液I:由葡萄糖,EDTA,Tris Cl组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒DNA;EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。 溶液II:由SDS与NaOH组成.SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH12)的作用是破坏氢键,使DNA分子变性。溶液III:由KAc与HAc组成,是pH值为5.5的高盐溶液.能中和溶液II的碱性,使染色体DNA

6、复性而发生缠绕并使质粒DNA复性.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒DNA分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。9、 碱裂解法抽提质粒DNA的基本原理是什么？答：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。PH介于12.012.5时，线性DNA变性，双链打开，而质粒DNA虽变性，但两条互补链彼此缠绕，当PH恢复到中性时，质粒DNA可迅速准确的完成复性，而线性DNA复性较困难，缠绕成网状，通过离心可沉淀除去。10、 在碱裂解法提取质粒DNA操

7、作中应注意哪些问题？答：（1）正确使用移液器。（2）溶液ll必须新鲜配制。（3）加入酚-氯仿后必须充分混匀。（4）混匀的过程不能太过剧烈。（5）每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。（6）吸取酚-氯仿溶液时要将Tip头插入液体分层的下侧。【可根据第一次试验自己写的注意事项进行补充】11、在碱裂解法提取质粒DNA时， 酚/氯仿的作用是什么？答：酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质12、 碱裂解法提取的质粒DNA分子一般有几种构象？电泳时移动速率有何差异？答：超螺旋DNA线性DNA开

8、环DNA13、 提取植物基因组DNA的基本原理是什么？在操作过程中应该注意什么？答：基本原理:利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经异丙醇沉淀。注意事项:材料要新鲜娇嫩，叶片研磨地越细越好；操作应为无菌操作；操作应温和，不宜剧烈晃动；注意移液器的正确使用。14、 在植物基因组提取过程中，DNA 降解的可能原因？答：原因:从植物中提取DNA时没对细胞内的DNA酶进行灭活；操作过程中被细菌污染了；口水等含酶物质飞入样品中；温度、PH等变化过于剧烈

9、。15、 在植物基因组提取过程中，提高 DNA 产量的措施？答：应当选取幼嫩的叶片，因为幼嫩叶片中的DNA含量高些；组织抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破坏；纯化时注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整个实验过程应该温和操作，不能剧烈振荡，混合过程要轻缓，减少抽提，减少DNA片段被认为降解，因为过度振荡会使DNA断裂成小片段。16、 在使用苯酚进行DNA提取时应该注意什么？答：酚一定要进行碱平衡，苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜、眼睛会对人体造成损伤，应当注意防护；它是出去蛋白质的，要充分振荡使蛋白质变性，但不能太剧烈而打断DNA；离心后应该避免再次吸入有机相的苯酚氯仿，尽

10、量只取上清，不应该让苯酚最后仍有残留，需抽提干净。17、 在提取植物基因组DNA过程中，使用苯酚与氯仿的作用是什么？答：用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保证提取的基因组较纯净。18、 在植物基因组提取过程中，该如何检测和保证基因组DNA的质量？答：检测：琼脂糖凝胶电泳；保证DNA活性:用EDTA抑制DNA酶活性，从而保证DNA不被破坏。19、 什么是限制性内切酶？答：限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，有三种类型，类，类，类，他们都有甲基化修饰功能和限制酶功能，类常用于分子克隆20、 常见的型限制性内切酶切割双链DNA后会产生

11、 末端或 末端。答：粘性，平21、下列有关限制性内切酶的描述，错误的是：（C）A一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制性内切酶的活性受温度的影响C限制性内切酶能识别和切割RNAD限制性内切酶可以从原核中提取22、 现有一长度为l 000 bp的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoR I酶切后得到的DNA分子仍是l 000 bp，用Kpn I单独酶切得到400 bp和600 bp 2种长度的DNA分子用EcoR I，Kpn l同时酶切后得到200 bp和600 bp 2种长度的DNA分子。请画出该DNA可能的酶切图谱。答：这是个大小为1000bP的环形的DNA分子，在1bP处和4

12、00bP处分别有一个Kpn 位点，在200bP处有一个EcoR 位点。23、一个限制性内切酶的识别序列和切割位点是5一GGATCC一3，在质粒上有该酶的一个切点，请画出质粒被该限制性内切酶切割后所形成的黏性末端。答：-G GATCC-写在上面，下面为-CCTAG G- 该酶为限制性内切酶I24、基因工程中，切割目的基因和载体所用的限制酶及切口必备的特点是(A)A可用不同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同B必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端可不相同C必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同D可用不同的限制性内切酶，露出不同的黏性末端25、在遗传工程技术中，限制性内切酶主要用于（

13、D）A. 目的基因的提取和导入B. 目的基因的导入和检测C. 目的基因与运载体结合和导入D. 目的基因的提取和与运载体结合26、 在分子生物学实验中，常使用微量移液器，请说明在使用微量移液器时需要注意什么？答：确定合适的量程，不可超过量程取液。取液时按到第一档，Tip头垂直进入液面3-5毫米取液。移液器注意不能接触溶液。打出液体时贴壁并有一定角度，要按到第二档将液体全部压出。使用完毕后，打下tip头，放好移液器。27、 现有量程为0.1-2.5 l；1-10 l；2.5-20 l；10-200 l；100-1000 l的移液器各一支，请问，当吸取0.15 l，0.5 l，5 l，15 l，10

14、0l，750 l液体时，各需要选取那种最佳量程范围的移液器？答：分别是0.1-2.5 ，0.1-2.5 ，1-10， 2.5-20， 10-200， 100-1000。28、 本学期我们学习了CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞和热休克法转化质粒DNA，你还知道哪些方法可以制备大肠杆菌感受态细胞和转化的方法？答：氯化铷法，甘油聚乙二醇法，一步法 29、 在质粒DNA转化大肠杆菌时，是如何进行筛选的？答：因为质粒pETBlue-2带有青霉素抗性基因,所以转化成功的大肠杆菌细胞能在含羧苄青霉素的琼脂糖平板上生长形成菌落.所以用含羧苄青霉素的琼脂糖平板可以筛选出转化成功的大肠杆菌。30、 蓝白班筛选的

15、原理是什么？答：见实验指导92面的实验原理的后半部分31、 在质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞时，如果将用来浸泡玻璃棒的酒精引燃起火该如何处理？答：用水打湿的毛巾，着火时用毛巾盖上就行了32、 卫星菌落出现的原因是什么？该如何避免？答：卫星菌落是氨苄降解后生长的杂菌 。可能是感受态细胞的问题也可能是转化过程出现操作失误例如未在冰中进行转化，感受态在常温下放置过久失活，转化后摇菌时间过短，或者摇床速度过慢，没有把菌摇起来，如果不是转化过程出现的问题就要进一步考虑连接是否正确，连接时间1216h，体系一般6ul-10ul，目的片段：载体一般1:31:10。可以将培养时间控制在12h-16h之间 ，

16、或者更换抗生素为羧苄青霉素。33、 影响所制备感受态效率的因素有哪些？答：影响因素有（1）大肠杆菌生长状态（2）氯化钙浓度（3）冰上放置时间（4）保存温度34、转化后为什么要温育1小时？为什么加入的是无抗培养基？答：第一问：温育就是让感受态恢复一下状态，以及一些相关抗性基因的表达。毕竟从-70环境中取出，需一段时间适应才可转化。第二问：因为细胞比较脆弱，加无抗培养基是为了让细胞生长，促使在转化过程中获得的新表型得到表达。35、 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？答：（1）操作过程仪器、器皿等不是无菌的，出现了一些杂菌和杂DNA 的污染 （2）细菌在感受

17、态时发生了一些自然变异，对所加的抗生素有一定的抗性，所以长出一些菌落 （3）所加的抑菌抗生素浓度不够，不能够抑制住细菌的生长 （4）一些实验误差，错将菌液放错36、在转化实验中，实验组和对照平皿应有什么样的结果？如何解释这个结果？答：实验组中长出菌落 而对照组中无任何菌落生长。37、 在学习制备感受态细胞时，为什么要保证细胞密度108/ ml？甘油的作用是什么？答：细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，密度过高或不足均会影响转化效率，一次要保证细胞密度108/ ml。甘油的目的是为了防止水在冻结过程中产生过大的冰晶损伤细胞，抑制大肠杆菌生长，以便保存。38、 通过分子生物学实验，你认为自己掌握

18、了哪些实验技能？你对分子生物学实验有哪些建议与意见？答：此为主观题，可结合所学知识发挥，言之有理即可。（比如凝胶电泳，PCR扩增等。）这门课程将分子生物学实验操作的理论与实践相结合，不仅使我在分子生物学实验技能方面得到系统的训练，而且让我对具体实验操作的原理有了清晰地认识。作为一门实验课，它还锻炼了我运用已学到的理论知识和已掌握的实验技能综合解决科学问题的能力。39、用琼脂糖凝胶分离DNA的理论依据是什么？答：DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速率向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的