水溶性亲和超滤载体的制备和应用_朱家文

1、V o l. 25 N o. 6华 东 理 工 大 学 学 报1999-12Jou rn al of Eas t C h ina U n ivers ity o f S cience and T ech no logy563水溶性亲和超滤载体的制备和应用+朱家文* 1,曹学君2, 武 斌1, 戴干策1, 邬行彦2( 1. 华东理工大学化学工程研究所, 上海 200237; 2. 华东理工大学生化工程系 )摘要: 用 D ex tran T 2000, 经环氧氯丙烷交联并氧化产生部分羧基, 偶联对氨基苯甲脒制得水溶性亲和载体巨配基。配基密度为 71. 4m o l /g。截留分子量为 10万的超

2、滤膜对所制亲和载体的截留率大于 99. 5%, 但尿激酶能自由通过。 将比活为 500IU /A 280的尿激酶粗品经亲和超滤得到纯化的尿激酶, 比活达 66 300IU /A 280, 纯度提高 133倍, 回收率达 83. 4% 。关键词: 亲和超滤; 葡聚糖; 尿激酶; 对氨基苯甲脒; 环氧氯丙烷中图分类号: Q 503; Q 55文献标识码: A文章编号: 1006-3080( 1999) 06-0563-04亲和超滤纯化活性蛋白药物是近年来颇受关注的生物分离新技术, 其特点是将亲和吸附与超滤结合起来, 兼具两者分离选择性好、提纯倍数高、能大规模连续操作和易于放大等优点。 亲和超滤所用

3、空白载体有两类, 一类是水不溶性微载体 1 3 , 另一类是水溶性大分子载体 4 5。 利用水溶性载体有许多优点: 亲和载体与目标蛋白在均相体系中反应速度快 , 达到吸附或洗脱平衡的时间极短, 吸附容量大。这一点对亲和超滤很有利, 可以将目标蛋白溶液与亲和载体溶液, 一边混合, 一边进行超滤, 而无需另备储槽进行反应; 洗脱时也一样6 。 另外, 水溶性亲和载体的吸附容量较大。葡聚糖是应用较多的水溶性载体, 因其为天然产物, 对人体安全, 相对分子质量大, 易于被膜截留,适用于注射用蛋白质药物的分离。 文献报道的亲和载体制备方法是将葡聚糖在催化剂存在下用环氧氯丙烷进行活化, 产生末端为氯的活性

4、基团, 进而与配基偶联。 此方法配基偶联反应活性低, 反应时间长 7 8 。 另一种制备葡聚糖亲和超滤载体的方法 9为葡聚糖在碱性下, 以环氧氯丙烷活化, 经胺化, 再与琥珀酸酐作用, 得到羧基末端, 再与配基偶联。 以该方法制备的载体用于亲和超滤研究取得了较好的结果, 但该法反应步骤多, 操作繁琐, 收率低。本文提出了一种新的制备葡聚糖亲和超滤载体的简易方法, 利用在碱性下加热, 当无还原剂存在时, 部分葡萄糖分子产生羧基, 同时, 加环氧氯丙烷进行交联 10, 然后, 在水溶性碳二亚胺存在下直接与带氨基的配基偶联而得到亲和载体。+ 国家自然科学基金资助项目 ( 29376235)*- :.

5、E m ailjzhunpc h ap lin k收稿日期: 1999-01-181 材料与方法1. 1 材料N -戊二酰-甘氨酰 -精氨酰 -7-氨基 -4-甲基香豆素 (GGA -M CA )和对氨基苯甲脒, 美国 S igm a公司; EDC ( 1-乙基 -3-( 3-二甲氨丙基 )碳二亚胺盐酸盐 ), 德国 M ERCK 公司; D ex tran T 2000(相对分子质量200万 ), Pharm acia 公司; 尿激酶标准品, 购于中国药品生物制品检定所; 尿激酶粗制品, 购于上海医药工业研究院生化室; 环氧氯丙烷为分析纯。1. 2 仪器F 950荧光分光计, 上

6、海第三分析仪厂; M 750微量可见紫外分光光度计, 上海生化所研制, 江苏泰州无线电仪器厂生产。中空纤维超滤器 (截留分子量为 10万 ), 天津纺织工学院生产。 平板超滤器 (截留分子量为 5 000), 美国 M ilipo re公司生产。1. 3 分析方法对氨基苯甲脒配基密度测定: 配基偶联后, 超滤反应液, 取超滤液在 292nm 测紫外吸光度, (E 1% =1cm800) 8 ; D ex tran T 2000浓度测定: 用旋光法 ( T=+ 199)11 ; 羧基密度测定: 0. 1m o l/L H C l滴定, pH从 7. 0滴定至 3. 012 ; 尿激酶活力测定:

7、荧光分光法13 , 发射波长为 380nm, 激发波长为 460nm; 蛋白质浓度测定, 在 280nm 处的紫外吸光度。1. 4 亲和载体制备取 2g D ex tran T 2000, 0. 8g (相当于 0. 4m o l /L N aC l) N aOH 溶于 50m L 水中, 加环氧氯丙烷 2. 0 m L, 于 60C 反应 2h, 超滤除去小分子残留反应物。加入对氨基苯甲脒 100m g, EDC 150m g, 保持 pH 4. 0 4. 5, 于室温反应 12h, 超滤除去残留反应物,564华东 理 工 大 学 学 报第 25卷得水溶性亲和载体。1. 5 超滤器对载体与尿

8、激酶的截留实验将 200m L 含 0. 5g 亲和载体的水溶液以全回流操作进行超滤, 滤液和保留液均回流至原液中 (操作方式见图 1), 在同一时间测定保留液和超滤液旋光度 , 计算载体截留率。图 1 全回流操作示意图.1Schem a tic d iag r amo f to ta l re cy clingF igo pe ra tio n m ode用含 0.4m o l/L N aC l的 0.05m o l /L 磷酸盐缓冲液 ( pH = 7. 5 ) 200m L 溶解尿激酶, 使成 2 000IU /m L, 也按图 1进行全回流超滤, 测定截留率。1. 6 吸附等温线在 2

9、5C 下将含有 500m g 亲和载体的溶液调节至 pH 7. 5, 0. 05m o l /L 磷酸盐含 0. 4m o l /L N aC ,l逐次加入尿激酶, 使混合液中尿激酶浓度分别为2 000、 4 000、 6 000、 8 000、 10 000IU /m L 不断递增,在不同浓度下测定超滤液中游离酶的浓度。1. 7 亲和超滤纯化尿激酶以图 2所示的操作方式, 将 200m L 含 0. 5g 亲和载体的水溶液调节 pH 7. 5, 0. 05m o l/L 磷酸盐含0. 4m o l /L N aC ,l 加入尿激酶使成 4 000IU /m L, 进行超滤, 加入相同的缓冲液

10、冲洗至 A 280为零。 用含0. 5m o l /L N aC l的 0. 1m o l /L 醋酸缓冲液 ( pH=图 2亲和超滤操作示意图F ig. 2S chem a tic d iag ram o f affinity u ltraf iltrat ion4. 0)洗脱, 收集洗脱液。用截留分子量为 5 000的超滤膜浓缩尿激酶, 测定酶与蛋白质浓度。2 结果与讨论葡聚糖与环氧氯丙烷在碱性下共热, 最好在有还原剂 N aBH4 存在下, 可发生如下反应 14 15:( I)中环氧基可进而与另一葡萄糖分子作用而产生交联 16 17 :第 6期朱家文等: 水溶性亲和超滤载体的制备和应用5

11、65如无还原剂存在, 葡萄糖也可被氧化形成羧基,其可能的反应如下 10 :分析表明, 葡聚糖经氧化后产生的羧基密度为71. 4m o l /g。在另一类似实验中环氧氯丙烷的加量降 低为 0. 5m L, 所得载体的羧基密度为53. 7m o l /g。在以后的实验中, 以前者为实验对象,因其可偶联更多的配基。水溶性亲和载体并不需要间隔臂, 从而省去了为引入间隔臂而增加的反应步骤。 在水溶性碳二亚胺存在时, 羧基能够和氨基反应形成酰胺键。在本实验中, ( II)能和对氨基苯甲脒偶联得到水溶性亲和载体, 也说明了确有羧基形成:EDC( II)+ H2NCNHN H2( II)CO NH C N H

12、 NH 2偶联配基反应中, 对氯基苯甲脒是过量的, 在 EDC 存在下, 羧基与对氨基苯甲脒的偶联反应是很完全的, 残留羧基对产品纯度并无不良影响。形成的( I), 其中环氧基在洗涤过程中会自动分解, 所以亦无妨碍。所制亲和载体和尿激酶溶液用截留分子量为10万的超滤膜进行截留实验, 结果见表 1。 Dex tranT 2000 经活化偶联配基后, 超滤膜的截留率从87. 8% 增加至 99. 5% 以上。 Dex tran T 2000的相对分子质量约为 200万, 比超滤膜的截留分子量大 20倍, 仍有约有 12. 2% 透过滤膜, 在经过几十倍体积的冲洗后, 几乎没有 D ex tran

13、T 2000剩下。 Dex tranT 2000虽然相对分子质量很大, 但为线性分子, 所以截留分子量为 10万的膜很难完全将其截留住。但由于有环氧丙烷的高度交联作用, 从而增加了膜对载体的截留性能, 而其它的氧化活化方法如高碘酸氧化法虽也能氧化产生羧基, 但并无交联葡聚糖的功能, 无法提高葡聚糖的膜截留率。 因此, 本法有一举两得之功。这是其它活化方法所无法替代的。表 1还显示, 实验所用的滤膜对尿激酶没有截留作用, 符合实验要求。表 1 亲和载体和尿激酶的截留率Table 1R ejection o f affin ity m acroligan d u rok inaseR ejecti

14、on rate (% )D ex tran2000-2000u rok in aseP A B Dextran87. 8 99. 50M o lecu lar w eigh t cu t-off m em brane is 1 105。以游离酶浓度 ( C )对载体吸附量 ( q)作图 (见图 3)按 langm u ir 方程形式进行回归, 得解离常数K d 为 471IU /m L, 最大吸附量 qm 为 4 993 IU /m g。图 3亲和载体对 U K 的吸附等温线.3A dso rp tio n iso therm o f a ffin ityF igm ac ro lig and

15、 w ith uro kinase所制亲和载体用于纯化尿激酶实验, 结果见表 2。表 2数据显示, 亲和载体对尿激酶有很好的纯化作用, 一次纯化倍数达到 133倍。 但回收率稍偏低, 这是因为在冲洗杂蛋白的过程中, 用了较亲和层析同等条件下多得多的洗涤缓冲液, 难免有少量尿激酶在冲洗过程中, 从配基上解离丢失。在洗脱过程中用去的洗脱液体积也较大, 通常为吸附液体积的10倍左右。 为克服洗脱体积过大的缺点, 可用一截留分子量为 1万的超滤膜截留尿激酶, 滤过洗脱液循环用于洗脱, 从而减少洗脱液用量, 并浓缩尿激酶。表 2 亲和超滤纯化尿激酶的实验结果Table 2Resu lts o f u r

16、ok in ase p ru ification b y affin ity u ltrafiltra tionM acroligan dPu rificationRecoveryS pecific activityfacto r(%)P -AB D ex tran T 200013383.466 300( IU /A 280 )3结 论Dex tran T 2000用环氧氯丙烷交联并氧化产生羧基, 偶联对氨基苯甲脒为配基是一个较好的用于566华东 理 工 大 学 学 报第 25卷亲和超滤纯化尿激酶的水溶性亲和载体。 其制备方法较为简便, 这种天然的载体特别适用于亲和超滤纯化注射用蛋白质药物。

17、致谢: 感谢 M illipo re中国有限公司上海办事处提供 M in itio n超滤设备, 使实验得以顺利进行。参考文献:1 M attias son B,L ing TGI.U ltrafiltra tion affin itypu rification A .M cG regor lWC.M em b raneS ep ara tionsinB iotechn ologyC . N ewY ork and Basel:M arce l D ekk er,1986. 99114.2 H erakDC,M errill EW.A ffin itycros s-flowfiltration

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