环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性研究报告

1、环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制 可行性研究报告可行性研究报告 目目 录录 第一章第一章项目基本情况项目基本情况.1 一、项目名称.1 二、项目承办单位概况.1 三、建设地点.1 四、项目负责人.1 五、建设规模及内容.1 六、总投资及资金筹措方案.2 第二章第二章项目建设必要性项目建设必要性.3 一、项目建设背景.3 二、项目建设必要性.5 第三章第三章市场预测市场预测.13 第四章第四章 技术来源技术来源.16 一、技术来源一、技术来源.16 二、已完成的研究开发工作二、已完成的研究开发工作.16 第五章第五章 建设方案建设方案.21 一

2、、项目组成.21 二、技术方案.21 三、设备方案.27 第六章第六章 投资估算和资金筹措投资估算和资金筹措.29 一、投资估算编制依据.29 二、投资估算.29 三、资金来源.30 第七章第七章贷款偿还方案及责任贷款偿还方案及责任.31 一、贷款偿还方式.31 二、偿还贷款责任.31 三、资金来源.31 第八章第八章 经济评价经济评价.32 一、编制依据.32 二、基本数据与参数.32 三、成本分析.32 四、经济效益分析.34 五、结论.34 一、选题的必要性 1、项目所处技术领域产业政策 本项目属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，项目 主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与

3、诊断需要进行检 测技术的研究与试剂盒的开发，本项目的实施可产生具有自主知识 产权的科研成果。本项目技术含量高，市场竞争力强，项目完成后 能够产生较好的经济效益和社会效益，项目符合国家产业、技术政 策。 2、项目所处技术领域技术发展现状 目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准 确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的 难题。本项目针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特 异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。 3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用 环介导等温扩增是利用 4 个特殊设计的引物和具有链置换活性 的 DNA 聚合酶

4、，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增 DNA 的新技 术。该技术在 1h 内能扩增出 109靶序列拷贝。LAMP 技术以其特异性 强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、 疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。该技 术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进 步有推动作用。 4、项目目前进展情况 课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本项目所需的科研 平台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温 扩增研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本项目的顺利完成 奠定了基础。 二、技术方案论述 （一）项目技术关键点和创新点，项目完成时达到

5、的技 术水平 1、技术关键 （1）本项目的技术关键之一是引物设计。与常规 PCR 引物不同， 环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有 6 个位点与靶序 列完全匹配才能够进行扩增。目前我们已从国际基因组数据库中下 载了部分病原菌的基因组 DNA，并根据基因组特点采用等温扩增软 件设计了部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。 （2）本项目的另一技术关键是最佳等温扩增体系优化。通过 对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP 浓度、 BstDNA 聚合酶用量、Mg2+浓度等条件进行优化，能够获得最佳实验 条件。 2、创新点 （1）既往对病原菌的检测一般采用细菌分离培养鉴定法

6、，但该 方法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。 近年来，人们将 PCR 技术用于病原菌的检测。PCR 技术虽然较传统 方法灵敏、快速，但需要较昂贵的仪器设备。更为重要的是，PCR 方法容易产生非特异性扩增产物，造成假阳性和假阴性结果，影响 对样品的正确判断。本项目将建立适合于食品和临床标本大规模检 测的环介导等温扩增快速检测病原菌技术。与目前的检测方法相比， 等温扩增法具有快速、准确、灵敏的特点。而且，等温扩增法是在 恒温下进行，只需一个简单的恒温装置，不需要 PCR 实验中的昂贵 仪器，因而易于在基层食品质量检测部门和医院推广使用。 （2）目前，国外已有将环介导等温扩增技

7、术应用于病毒 DNA 和 RNA 检测的报道，但将其应用于病原菌检测的文献报道极少，国 内基本上还未开展环介导的等温扩增研究工作。本项目首次提出将 环介导的等温扩增技术应用于食品和临床标本中病原菌的检测，并 对目前的等温扩增方法提出改进策略，发展可同时检测多种病原菌 的多重等温扩增技术，以克服当前一个等温扩增反应只能检测一种 DNA 或 RNA 的缺点。因此，本项目的实施，将开发出具有自主知识 产权的病原菌检测试剂盒。 3、项目完成时达到的技术水平 项目完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术 及其配套试剂盒达到国际先进水平。 （二）项目技术方案 1、技术方案 （1）环介导等温扩增（

8、LAMP）和多重等温扩增快速检测常见 病原菌方法的建立 常见病原菌特异性 LAMP 引物的设计。根据 GenBank 数据库 公布的常见病原菌 DNA 序列，采用 LAMP 专用引物设计软件设计特异 性 LAMP 引物（包括每类致病菌的两个外引物、两个内引物和两个环 引物，其中每个内引物均具有两段能够识别靶分子上特定位点的序 列，以保证靶序列的特异性扩增。 ） 常见病原菌基因组 DNA 的提取。采用本实验室建立的基因组 DNA 快速提取技术提取致病菌 DNA。 LAMP 扩增反应体系的优化：对引物浓度、内引物和外引物的 最佳浓度比、模板浓度、dNTP 浓度、BstDNA 聚合酶用量、Mg2+浓

9、度 等条件进行优化。 温育条件的优化：在 55-65之间优化等温扩增温度。 扩增产物的检测：建立快速显色法和电泳分析法两种检测扩 增产物的方法。 以上述研究结果为基础，建立常见病原菌的环介导等温扩增 和多重环介导等温扩增快速检测技术。 （2）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的灵敏度分 析 将常见病原菌目标基因克隆至 pMD-18T 载体，转化后提取质粒， 倍比稀释成含目的基因拷贝数为 105、104、103、102、101，以其为 模板做环介导等温扩增反应，检测本方法的灵敏度。 （3）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的特异性分 析 分别以病原菌和非病原菌基因组 DNA 为模板做环介

10、导等温扩增 反应，检测本方法的特异性。 （4）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法与国际标准 方法及常规 PCR 扩增方法比较分析 以 LAMP 的两个外引物做常规 PCR 扩增，并与 LAMP 的扩增结果 进行比较分析，进一步判断 LAMP 技术的灵敏度、特异性和稳定性。 （5）常见病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测 方法在食品检测和临床诊断中的应用研究 将本方法应用于食品检测和临床诊断中，分析本方法对不 同样品检测的准确率。 （6）病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测试剂 盒的研制 根据本项目所建立的 LAMP 最佳反应体系和 LAMP 反应产物显示 方法，研制开发快速

11、检测病原菌的试剂盒（包括单一病原菌检测试 剂盒和多种病原菌同时检测试剂盒） 。 2、工艺流程 引物优化、组合 LAMP反应体系的建立 灵敏度试验特异性试验反应条件优化阴性对照阳性对照 试剂盒 中试 同类产品比较试验国标法比较试验 LAMP方法应用于病原体检测 样品收集 核酸提取引物设计 基因序列分析 （三）项目技术质量指标 （1）本项目建立的方法对病原菌检测的准确率达到 95%。 （2）本项目建立的方法对病原菌目的基因检测的灵敏度达到 101拷贝。 （3）本项目建立的方法不产生非特异性扩增产物。 （4）对病原菌目的基因的等温扩增过程在 30-60 分钟内完成， 显色法检测扩增产物在 5 分钟内

12、完成，电泳法检测扩增产物在 60 分 钟内完成。 （四）项目执行过程中各阶段目标 2007 年度 第一季度：设计引物，引物合成，购买实验菌株和有关试剂， 完善实验条件。 第二季度：样品采集，病原菌 DNA 提取。 第三季度：等温扩增反应体系优化，温育条件优化。 第四季度：扩增反应产物检测方法的建立（快速显色法、电泳 分析法） 。 2008 年度 第一季度：环介导等温扩增快速检测病原菌方法操作程序确定， 多重等温扩增同时检测多种病原菌实验技术建立。 第二季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法的准确度分析。 第三季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法的灵敏度分析。

13、第四季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法与常规 PCR 扩增方法比较分析。 2009 年度 第一季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法在食品和临床标本上的应用及效果分析。 第二季度：环介导等温扩增快速检测病原菌试剂盒和多重等温 扩增试剂盒研制。 第三季度：试剂盒的应用及技术推广。 第四季度：课题总结，鉴定。 （五）项目经费预算情况 本项目申请科研经费 5 万元。其中设备、仪器购置费 1 万元； 材料、样品加工费 0.5 万元；土建安装费 0.5 万元；资料、调研费 0.5 万元；实验、检测费 2 万元；鉴定费 0.5 万元。 三、项目实施支撑条件 1、项目技术

14、来源 本项目的技术由项目申请人建立。 2、项目实验、检测条件 项目申请人所在学院生命科学学院拥有食品科学国家重点建 设学科、生物化学与分子生物学省级重点学科和食品科学教育部重 点实验室。这些重点学科和重点实验室设施完善、先进，具有进行 本项目研究的实验条件和实验场地，为本项目的完成提供了保障。 项目申请人所在的江西省生物化学与分子生物学重点实验室实 验条件先进，具有 PE-9700 型 PCR 仪，全自动 DNA 测序仪（ABI Prism 3100 型） 、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机、超低温冰箱、 Milli-Q 超纯水系统、各种规格的电泳仪、紫外分光光度计、设施 先进的细菌培养室等仪器

15、设备。现已完成了本项目所需的科研平台 建设工作。 项目申请人长期从事分子生物学研究工作，熟练掌握了分子生 物学研究技术。课题组已开展了本项目的前期研究工作，目前正在 进行嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，基本掌 握了等温扩增专用引物设计软件的使用和等温扩增的操作要点，这 为本项目的顺利完成奠定了技术基础。 3、项目申请单位人才资源情况 项目申请单位南昌大学是我省唯一一所省部共建的“211”工 程重点建设大学，人才资源丰富，科研力量雄厚。生命科学学院有 专任教师 150 人，其中正副教授 60 人，讲师 28 人，中高级技术人 员比例 2:1。 4、项目组人员专业结构、职称结构 项

16、目组科研人员 7 人，主要由生物化学与分子生物学专业、微 生物学专业人员组成，专业结构合理。科研人员中，教授 2 人、副 教授 2 人、研究生 3 人。其中具有博士学位的教师 2 人。 5、项目新增投资筹集情况 本项目申请科研经费 5 万元。 四、项目预期经济效益 1、预期市场需求 病原菌的检测是食品检测和临床诊断中的常规项目，食品检测 部门和医疗机构对检测试剂的需求量巨大。等温扩增技术在病原菌 的检测工作中有很大潜力。然而，目前国外仅有将其用于病毒 DNA 和 RNA 检测的研究报道，在病原菌检测领域尚无以此技术开发的商 业试剂，国内也未见这方面的研究开发报道。因此，开发病原菌的 环介导的等

17、温扩增试剂具有广阔的前景。 2、预期盈利水平 目前以传统方法检测一个样品中的一种致病菌的收费约 50 元。 本项目建立的检测技术检测一个样品的试剂成本约 8 元，如果以 20 元销售，可获利润 12 元。一个小型试剂生产企业一年至少可生产检 测 50 万个样品的试剂，每年获利 600 万元。因此，该技术的推广可 产生明显的经济效益。 3、预期产业化前景 本项目是针对严重影响人类健康的病原菌的检测问题提出的， 研究成果的实用性强，易于转化。在产品的研制工作中采用了现代 分子生物学新技术，产品的科技含量高，生产成本低，利润空间大。 本产品的生产不需特殊大型设备，产品定型后可向中小型生化试剂 生产企

18、业转让，因此，本项目的产业化前景广阔。我省具有一定生 产能力的试剂生产企业经技术培训后可生产本产品。 4、项目实施风险分析 课题组已开展了本项目的前期研究工作，目前正在进行嗜水单 胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增研究，基本掌握了等温扩 增专用引物设计软件的使用和等温扩增的操作要点，这为本项目的 顺利完成奠定了技术基础。项目申请人所在实验室为江西省生物化 学与分子生物学重点实验室，实验条件先进，现已完成了进行本项 目研究的科研平台建设工作。因此，本项目的实施基本上不存在技 术风险。 常规检测病原菌的细菌培养分离鉴定法费时费力，近年发展起 来的 PCR 鉴定法易产生非特异性产物，导致假阳性或假阴性结果。 与常规检测技术和 PCR 技术相比，环介导的等温扩增技术具有快速、 准确、灵敏、低成本等优点。在本项目的研究中，我们还将建立一 次测试能够检测多种致病菌的多重环介导等温扩增新技术。该技术 易于质控，适用于大批量样品同时检测，值得在食品病原菌普查和 人体健康普查工作中推广应用。环介导等温扩增新技术以其明显的 优势将完全能够取代目前使用的常规分析方法和 PCR 方法，成为病 原菌检测中的主要检测方法。因此，本项目的成果转化基本上不存 在市场风险。 五、项目预计社会效益、环境效益 1、对社会发展的作用 本项目