剔除自体活化CD8T细胞对MDS体外祖细胞培养集落形成的影响

1、上海交通大学硕士学位论文剔除自体活化cd8t细胞对mds体外祖细胞培养集落形成的影响姓名：张倩乔申请学位级别：硕士专业：内科学（血液学）指导教师：李晓20090501上海交通大学硕士研究生学位论文 而正常对照组，cd34,cd33,cd13剔除活化cd8t培养前后略有改变,但差异无统计学意义。（4） 2 例单纯8异常低危mds病例，治疗前收取骨髓标本，剔除cd8cd57 t细胞培养前，+8克隆细胞比例分别为17%和27.6%，剔除cd8cd57 t细胞培养后，+8克隆细胞比例各自为47%和54.4%。2例20q异常的初治病例，剔除cd8cd57 t细胞培养前，异常克隆细胞比例分别为45和15，

2、剔除cd8cd57 t细胞培养后，异常克隆细胞比例增加为57和43.6。 结论 在体外选择性剔除骨髓中自体活化cd8t细胞，可以增加mds患者骨髓体外培养祖细胞集落形成，集落中髓系细胞向较成熟阶段分化。提示cd8cd57双阳性细胞可能通过免疫途径参与骨髓无效造血。而剔除活化cd8细胞造成克隆细胞明显增加，提示cd8介导的免疫过程可能主要是针对mds骨髓恶性克隆细胞。 关键词 骨髓增生异常综合征；cd8 淋巴细胞；免疫抑制 上海交通大学硕士研究生学位论文 abnormally activated t lymphocyte impact on ineffective hematopoiesis i

3、n vitro in myelodysplastic syndrome abstract objective to investigate how activated cd8 t cells playing a role in hemopoiesis,bone mononuclear cells (bmnc) from mds were removed of abnormally activated cd8 t cells in vitro and cultured to find out the effect of that t cells on mds hemopietic progeni

4、tor. methods bone mononuclear cells (bmnc) from 40 patients with low-grade mds and 5 patients after immunosuppression treatment,and 5 normal donors were depleted of cd8cd57 t lymphocytes using magnetic sorting. depleted and plused cd8cd57 t bmnc were inoculated in methycellulose and the correlation

5、of colony-forming-cells(cfc) number and the polarization of t cells were analyzed, the generation of cfc, the immunophenotype and the clonal cells(which had cytogenetic markers detected by fish),was compared respectively. results （1） the capacity of bmnc from 5 healthy donors to generate cfc remaine

6、d unchanged in the cd8cd57 t lymphocyte-depleted and plused cd8cd57 t bmnc. in contrast, cultures initiated with cd8cd57 t lymphocyte-depleted bmnc from 15 patients with low-grade mds exhibited significantly increased generation of cfc compared 上海交通大学硕士研究生学位论文 with the corresponding plused cultures,

7、and 7 patients just forming cell clusters,18 patients not forming any colonies or clusters,but cell density is intensiver than which bmnc plus t lymphocyte in. （2）the number of cfu-g after 14 days culture of delected-cd8cd57 bmnc has correlation with the polarization of tc,and non correlation with t

8、he polarization of th.（3） the percentage of cd34 in bmnc of low-grade mds was higher than that in healthy donors（1.290.49% ）vs.（0.780.29%）(p 0.05), that of cd33 in bmnc of low-grade mds was significantly higher than that in healthy donors（24.251.91）% vs.（13.801.78）%（p0.05), and that of cd13 in bmnc

9、of low-grade mds was significantly higher than that in healthy donors（19.581.35）% vs. （11.601.8）%（p0.05）. after cultivation , the percentage of cd34 in low-grade mds decreased to (0.250.31)(p 0.05），that of cd33 decreased to （14.632.60）%（p0.05）,but the percentage of cd34,cd33 and cd13 had no signific

10、antly changed in healthy donors between pre-culture and post-culture.（4） two patient with trisomy 8 in bone marrow cell, pre-treament(atg/csa) depleted of cd8cd57 t, increased the percentage of trisomy 8 from 17%&27.6% to 47%&54.4%.two patients with 20q-, pre-treament(atg/csa) depleted of cd8cd57 t,

11、increased the percentage of malignity cell from 45% &15% to 57% & 43.6%. key words: myelodysplastic syndrome;cd8t lymphocyte; immunosuppression 上海交通大学硕士研究生学位论文 主要符号和缩略语说明 mds (myelodysplastic syndrome) 骨髓增生异常综合征 ra (refractory anemia) 难治性贫血 rars (refractory anemia with ring siderblast) 伴环型铁粒幼细胞增多的难治

12、性贫血 rcmd（refractory cytopenia with multilineage dysplasia）难治性血细胞减少伴多系发育异常 rcmd-rs（refractory cytopenia with multilineage dysplasia and ringed sideroblasts）难治性血细胞减少伴多系发育异常伴环形铁粒幼细胞增多 raeb-1 (refractory anemia with excess blast-1) 难治性贫血伴原始细胞增多1型 raeb-2 (refractory anemia with excess blast-2) 难治性贫血伴原始细胞

13、增多2型 bmnc (bone marrow mononuclear cell) 骨髓单个核细胞 cfu (colony forming unit) & cfc(colony forming cell) 集落形成单位或细胞 cfu-e (colony forming unit-erythriod) 红系集落形成单位 cfu-g (colony forming unit-granulocyte) 粒系集落形成单位 cfu-ge (colony forming unit-granulocyte，erythriod) 粒红系集落形成单位 tnf-（tumor necrosis factor-）肿瘤坏

14、死因子- 上海交通大学硕士研究生学位论文 inf-（interferin-）-干扰素 fcm (flow cytometry) 流式细胞术 fish (fluorescence in situ hybridization) 荧光原位杂交 ipss（international progress sessment systerm）国际预后积分系统 who (world health organization) 世界卫生组织 trail(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand) 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导 上海交通大学硕士研究生

15、学位论文 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海交通大学硕士研究生学位论文 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或

16、部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 1第一章 绪 论 11 研究背景 骨髓增生异常综合征作为一种引起外周血细胞减少伴骨髓增生异常并有向白血病转化趋势的一组异质性克隆性造血干细胞疾病，其发病机制一直是血液学研究的热点。随着工业化程度的提高和人们生活方式的改变，其年发病率已超过白血病达到4-12/10万人口/年甚至更高，且其中20%30%病人最后转化为急性白血病。因此，对该疾病发病机制

17、的研究及由此探索深层有效的治疗有着迫切的临床需要。 进年来，对mds的研究认为，其发病机制是多重性的，它包括: 造成造血干细胞的损伤或突变, 可能引起了一种免疫反应, 不利于祖细胞的存活; 一些细胞因子增加了骨髓细胞的过度增殖和提早凋亡; 肿瘤抑制基因活性的丧失导致疾病的进展。越来越多的研究证据支持在mds 的发病机制中, 存在自身免疫的过程。国内外报道证实mds 患者存在t 细胞免疫功能紊乱,如cd3 + 细胞下降,cd4 + / cd8 + 倒置,细胞毒性t淋巴细胞（cytotoxic t cell，ctls） 相对升高, t 细胞寡克隆的存在等。应用流式细胞仪检测mds 患者(包括ra

18、和raeb 两组)骨髓和外周血中的cd8+t细胞亚群,发现ra 组cd8+cd11a+t细胞(激活的ctls)增高, raeb组则未见增高。此外,cd56+cd16+cd3-细胞(nk细胞)见于ra患者,而未见于raeb 患者。研究者认为,ra 患者的ctls 和nk细胞被激活后发挥了免疫监视的功能,从而抑制恶性克隆的增殖,而raeb患者的ctls 和nk细胞可能未被激活，肿瘤逃逸，导致向白血病的快速进展。1本实验室既往研究也证实了这一点：mds骨髓中th1、tc1细胞比例增高，th1/th2、tc1/tc2平衡向型反应极化，其中以who分型rcmd组、ipss评分低危组、核型正常组病人的t细

19、胞型反应极化明显。2而在高危mds病人，可以观察到th1/th2比值的降低，原始细胞数与th1细胞数呈负相关，提示在mds向aml转化过程中存在th1/th2的动态变化，同时在低危mds患者可观察到的过度凋亡现象在高危患者不明显，也提示了低危患者体内th1,tc1介导的细胞免疫占主要地位；而在高危mds患者中，细胞免疫功能低下，对mds恶性克隆细 2胞清除能力下降，骨髓原始细胞增加，疾病进展。3-4针对中低危mds患者存在的免疫功能紊乱，对其使用免疫抑制剂治疗，取得很好的疗效5-7。有研究者归纳出对免疫抑制剂反应较好的mds患者特征如下:ra亚型，骨髓原始细胞10，t 细胞功能亢进,无恶性克隆

20、证据,hla-dr2 或hla-dr15表达阳性8。mds患者外周血t细胞与正常对照相比，有tcr v有显著增多的异常v谱系表达。cd8+ t细胞数量的增加与tcr转录子的表达水平呈正相关。提示mds的cd8+t细胞呈现单克隆或寡克隆扩增。11 10有研究者用免疫抑制剂如抗胸腺细胞球蛋白(atg)和环孢霉素a治疗mds，显示部分患者骨髓造血功能得到改善，并出现t 细胞受体v (tcr v) 表达谱的改变（由寡/单克隆转变为多克隆），提示t 细胞介导的mds骨髓造血祖细胞抑制情况好转9。我们已有的研究证实部分mds患者体内ifn-和tnf-等促凋亡细胞因子水平显著上升，而分泌这些负性调控因子的型

21、t细胞亚群(th1、tc1细胞)的数量及比例也有所增加，提示型t细胞亚群在mds发病中起到重要作用。12本实验在既往研究的基础上，利用免疫磁珠分选的技术，在体外剔除活化的型t细胞（cd8cd57t细胞）后，观察mds患者骨髓干/祖细胞体外培养细胞集落形成能力，观察培养前后mds髓系细胞标记及异常克隆细胞比例的变化，分析活化的型t细胞在疾病的发生发展过程中的作用及可能的作用方式，以期为临床免疫抑制剂的使用提供更多的理论依据及进一步为病人提供个体化治疗。 12 本实验的研究工作和内容安排 本实验的研究工作主要有以下几个方面：在体外剔除mds患者及正常人骨髓单个核细胞（bmnc）中cd8cd57双阳

22、性的t淋巴细胞，将剔除cd8cd57t细胞后的bmnc及加回cd8cd57 t（4倍）的bmnc分别培养，比较培养后细胞集落生长情况差异。分析低危mds组细胞集落生长情况同t细胞极化状态相关性。比较培养前后髓系细胞标志的变化及克隆细胞比例变化。用以上方法分析两例雷立度胺治疗有效患者的具体情况。 本论文的主要内容安排如下： 第一章： 绪论部分，概述mds免疫学发病机制研究进展，阐述本论文研究思路和实验方案。 第二章：用免疫磁珠法在体外剔除低危mds患者及正常人骨髓单个核细胞（bmnc） 3中cd8cd57双阳性t淋巴细胞，剔除cd8cd57 t及加回cd8cd57 t（4倍）的bmnc分别培养，

23、比较细胞集落生长数量差异。 第三章：分析mds病人骨髓单个核细胞（bmnc）剔除cd8cd57 t培养后，细胞集落（cfu）计数同cd4/cd8比及t细胞极化偏移相关性，明确t细胞极化偏移对bmnc培养集落生长的影响。 第四章：用免疫组化方法比较mds患者bmnc培养前后髓系细胞标记变化。 第五章：用fish方法比较mds患者bmnc培养前后异常克隆细胞标记变化。 第六章：总结。 13 本论文的创新 本实验选取cd8cd57双阳性t细胞作为mds患者骨髓中异常活化的型t细胞，与既往实验选取外周血cd8t细胞相比较，本实验定位更为准确，有助于深入探讨骨髓增生异常综合征发病机制中的免疫途径。 研究

24、了剔除自体活化cd8t细胞对mds干/祖细胞髓系分化的影响及mds克隆细胞的影响，虽然方法比较简单，但是观察到了非常有趣的改变，并很好的佐证本实验的理论基础。 选取了6例常见的异常染色体核型的患者做具体分析，为临床上免疫抑制剂的使用提供更多的理论依据和实验支持。为深入探讨免疫抑制治疗的机制提供参考。 参考文献 1iwase o , aizawa s , kuriyama y, et al. analysis of bone marrow and peripheral blood immunoregulatory lymphocytes in patients with myelody -spl

25、astic syndromej. ann hematol, 1995 ,71 (6) :293-299. 2wu ly, li x, chang ck, et al. deviation of type i and type ii t cells and its negative effect on hematopoiesis in myelodysplastic syndrome. international journal of laboratory hematology online. 3kochenderfer jn, kobayashi s, wieder ed,et al.loss

26、 of t-lymphocyte clonal dominance in patients with myelodysplastic syndrome responsive to 4immuno- suppressionj. blood 2002,100:36393645. 4barrett j, saunthararajah y, molldrem j. myelodysplastic syndrome and aplastic anemia: distinct entities or diseases linked by a common path -ophysiologyj.semin

27、hematol 2000,37: 1529. 5molldrem jj,leifer e,bahceci e, et al. antithymocyte globulin for treatment of the bone marrow failure associated with myelodysplastic syndromesj.ann intern med, 2002 ,137 (3):156-163. 6shimamoto t , tohyama k, okamoto t , et al. cyclosporin a therapy for patients with myelod

28、ysplastic syndrome : multicenter pilot studies in japanj. leuk res , 2003 ,27(9): 783-788. 7jonasova a , neuwirtova r , cermak j , et al.cyclosporin a therapy in hypoplastic mds patients and certain refractory anaemias without hypoplastic bone marrowj.br j haematol, 1998,100(2):304-309. 8mufti g, li

29、st af, gore sd,et al.myelodysplastic syndrome. hematology am soc hematol educ program,2003:176-199. 9kochenderfer jn,kobayashi s, wieder ed, et al. loss of t-lymphocyte clonal dominance in patients with myelodysplastic syndrome responsive to immunosuppressionj. blood,2002,100(10):3639-3645. 10eppers

30、on de, n akamura r, saunthararajah y, et al. oligoclonal t cell expansion in myelodysplastic syndrome: evidence foranaul to immuneprocessj. leuk res,2001,25(12):1075-83. 11matsutani t, yoshioka t, tsuruta y, et al. determination of t cell receptors of clonal cd8 positive t cells in myelodysplastic s

31、yndrome with erythroidhypoplasiaj. leuk res,2003,27(4):305-312. 12li xiao, bryant e, deeg hj. simultaneous demonstration of clonal chromosome abnormalities and apoptosis in individual marrow cells in myelodysplastic syndromej.int j hematol,2004,80(2):140-145. 5第二章 mds患者与正常人bmnc剔除活化cd8 t细胞后体外培养cfu形成情

32、况的比较 引言 骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes,mds）作为一组起源于骨髓造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，其发病机制至今尚未完全清楚。近年来，越来越多的临床和实验研究表明，免疫异常在mds的发生发展过程中扮演重要角色，临床观察到mds患者进行性血细胞减少伴有t细胞寡克隆显著扩张，而免疫抑制剂对部分低危mds患者疗效显著，据此现象推测t细胞可能介导mds患者造血干细胞抑制【13】。低危mds患者可以观察到t细胞数量增加及功能增强，cd4与cd8比例倒置，cd4及cd8细胞亚群呈现向th1 和tc1极化的现象，可能与细胞过度凋亡和骨髓衰竭有关【4】。cd8tc

33、淋巴细胞被认为是mds免疫异常网络中的重要细胞，cd8+tc细胞可以根据其分泌的细胞因子和功能的不同分为两种不同的亚型：tc1和tc2细胞。tc1/tc2的极化走向是机体免疫应答调节的关键环节，型和型t细胞的相互平衡与否直接影响机体的免疫功能，并且与疾病状态密切相关。 cd57 (leu-7) 是分子量为110 kd 的糖蛋白，是人类nk细胞的标志,当其与靶细胞上的配体特异性结合后,能够激活nk细胞的细胞毒作用。这些nk细胞标志也表达于部分t淋巴细胞,主要是ctls 的表面,它们与ctls 的效应功能有关5。在骨髓和其他器官移植术后、类风湿性关节炎及aids 患者,cd57 + t 细胞均增高

34、6。已有的研究显示：cd57 + t 细胞能够分泌大量的ifn-, 且分泌能力与细胞数量有关 ,而ifn-在抗肿瘤免疫及th1 型反应中起重要作用7。 cd8+cd57+ t细胞与移植后或移植相关的持续性或再发性病毒感染有关，例如 细胞巨化病毒或hiv8-12。体外实验表明，促细胞分裂剂诱导增殖的t，b细胞表现出的抑制性细胞功能提示其在移植病人体内对于控制淋巴细胞抗病毒抗原的反应性或耐受状态起重要作用9,13,14。相反的，cd8cd57淋巴细胞在体外实验中也表现出淋巴因子激活的杀伤细胞前体的作用15，这一作用被证明是在cd3刺激下产生的17。 6本实验中，选取cd8+cd57+ t细胞作为体

35、外激活cd8 tc型细胞的表面标志，利用磁珠分选系统分选，将所得到的阳性组份作为抑制因素加回患者骨髓bmnc细胞中，在体外模拟体内环境进行共培养，同时将剔除了阳性组份的患者骨髓bmnc在同等条件下进行培养，14天后将两者相比较观察。 2.2 材料和方法 2.2.1 病例选择 mds确诊病例55例，其中男25例，女30例，中位年龄46（1276）岁。按照国际预后积分系统（ipss），主要选择50例中危1以下（ipss1）的mds患者进行该实验。根据who分型，难治性血细胞减少伴多系增生不良（rcmd）41例，难治性贫血伴原始细胞增多1型（raeb-1）2例，rars2例，ras2例，ra1例，m

36、ds/cmml1例，mds-u1例。在50例病人中，有17例经染色体核型分析（g 带）证实有克隆性标记，所有50例病人在进行本研究时均未接受过化疗或细胞因子治疗，另10例为接受免疫治疗后复查。5名正常志愿者的骨髓标本做为正常对照，其中男3例，女2例，中位年龄40（2752）岁。具体资料见表1。 表1：病人资料 sex age diagnose blast chromatosome neutrophils ipss f 40 rcmd 2% nor 1.3 int-1 f 73 mds/cmml 2% +8 7.1 low m 45 rcmd 2.5% complex 4.3 low f 33

37、rcmd 1.5% nor 7.9 low f 34 rars 4.5% nor 0.38 int-1 m 70 rcmd 2.5% del(7)t(1;7)(q24;q31) 1.04 int-2 f 37 rcmd 0% nor 1.95 int-1 m 57 ras 3.5% nor 1.83 low f 44 mds-u 0 nor 4.2 low m 32 rcmd 0 +8 2.25 int-1 m 35 rcmd 3% nor 1.04 int-1 f 22 rcmd 3% nor 1.97 int-1 f 33 rcmd 4.5% nor 1.03 int-1 7f 40 rc

38、md 0.5% nor 0.92 int-1 f 37 rcmd 1% nor 1.4 int-1 m 31 rcmd 3% +8,del(20) 0.36 int-1 m 55 rcmd 4% del(20) 1.38 int-1 m 64 raeb-t 7% del(5) 0.44 int-1 m 42 rcmd 0.8% nor 1.94 low f 53 rcmd 0.2% nor 1.17 int-1 m 46 rcmd 0.5% nor 3.08 int-1 f 30 rcmd 1% nor 2.0 int-1 f 34 rcmd 2.5% nor 0.9 int-1 m 23 r

39、cmd 1.5% nor 1.33 int-1 f 58 rars 0.5% nor 1.19 int-1 f 45 rcmd 1% 48,xx,+8,+9,15 0.97 int-1 f 41 rcmd 4.5% nor 1.9 int-1 m 71 rcmd 3.5% nor 2.2 int-1 m 64 rcmd 0.2% del(5) 1.65 int-1 m 41 ra 0 nor 2.1 low f 47 rcmd 1% nor 1.64 int-1 f 12 rcmd 0.5% del(20) 0.82 int-1 m 73 rcmd 2% nor 0.87 int-1 f 34

40、 rcmd 1.5% del(7) 2.03 int-2 f 52 rcmd 0.5% del(20) 2.18 int-1 f 55 rcmd 3% nor 1.74 int-1 f 42 rcmd 1% nor 1.5 int-1 m 57 rcmd 2% nor 2.04 int-1 f 49 rcmd 3% nor 0.44 int-1 m 27 rcmd 0.5% nor 1.32 int-1 f 33 rcmd 1% nor 2.46 low m 57 rcmd 2.5% nor 1.51 int-1 f 29 rcmd 0% nor 1.64 int-1 m 37 rcmd 1%

41、 nor 2.15 int-1 m 60 rcmd 0% 46,xy,del(6)p229 0.87 int-1 f 55 rcmd 2% 47,xx,+83 0.79 int-1 m 62 ras 1% nor 4.18 low m 17 rcmd 0% +8 0.58 int-1 m 45 rcmd 0% nor 1.12 int-1 f 76 raeb-1 5% 46,xx,t(6;9)(p23;q34) 0.7 int-2 m 75 rcmd 2.5% del(20) 3.55 low f 42 rcmd 0.5% nor 0.9 int-1 8f 51 rcmd 1% nor 1.3

42、9 int-1 m 75 rcmd 2.5% 45,x,-y,del(5)/+8 3.1 int-2 免疫治疗后 m 65 rcmd 0.5 del(5),del(20),+8 1.4 int-1 m 42 ra 0% nor 4.15 low m 55 rcmd 1% nor 2.59 low f 32 rcmd 0% del(7) 1.85 int-2 f 55 rcmd 1% nor 1.48 int-1 m 58 rcmd 0.5% nor 1.5 low 2.2.2 主要试剂、仪器设备 1.淋巴细胞分离液（ficoll，cedarlane公司产品） 2.hbss、pbs（gibco公

43、司产品，ph7.2，不含ca2+、mg2+） 3.cd4 multisort kit，human（德国miltenyi biotec公司产品） 4.anti- hccr5（r&d公司产品，抗体末端标记为pe） 5.分选buffer（pbs/hs/edta） 6.分选柱子（ms column）（德国miltenyi biotec公司产品） 7.无菌15 ml、50ml离心管（美国corning公司） 8.无菌150mm、35 mm培养皿（美国corning公司） 9.低温高速离心机（beckman coulter） 10.human methylcellulose complete media中

44、(hsc003，r&d公司产品，货号390395，contents：1.3% methylcellulose，2% bovine serum albumin ，25% fetal bovine serum,2mm l-glutamine，510-5m 2-mercaptoethanol，50ng/ml recombinant human scf, 10ng/ml recombinant human gm-csf, 10ng/ml recombinant human il-3, 3u/ml recombinant human epo) 11三洋co2培养箱(型号mco-15ac,日本sanyo公

45、司产品) 12垂直层流洁净工作台（型号ca-1390-1，上海医用仪器设备厂） 13倒置相差显微镜（型号37xc，上海医用仪器设备厂） 14显微镜成像系统（型号is ，上海宙山精密光学仪器有限公司） 223 实验方法 92231 骨髓液的采集及处理 以b65-01骨髓活检针于髂后或髂前上棘局麻后抽吸骨髓液58ml，用hbss（gibco公司产品，ph7.2，不含ca2+、mg2+）同骨髓液按等比例稀释，混匀后将稀释骨髓液置于淋巴细胞分离液（ficoll，cedarlane公司产品）上，转速400g，在室温下离心35min，取出ficoll上云雾状单个核细胞层（bmnc），pbs（gibco公司

46、产品，ph7.2，不含ca2+、mg2+）洗涤2次，计数备用。 bmnc分选 所有病例均进行两步磁珠分选。采用cd8 multisort kit，human（德国miltenyi biotec公司产品）进行分选，二抗为anti- hcd57（r&d公司产品，抗体末端标记为pe），按照miltenyi biotec提供的说明书进行操作。下述操作均在洁净工作台中进行。取4.8106bmnc细胞悬液离心后用pbs洗涤两次，彻底吸去上清，将细胞用冷分选buffer（pbs/hs/edta）重悬（每107细胞加缓冲液70ul），加入cd8单抗磁珠（每107细胞加20ul磁珠），混匀48孵

47、育5分钟后，加入二抗anti- hcd57（每107细胞加10ul）孵育10分钟，用分选buffer洗一次（107细胞加分选buffer 1-2ml），转速400g，离心10min，彻底吸弃上清，用500ul分选buffer重悬细胞。将柱子（ms column）置于macs磁珠分离器上，用500ul分选buffer充洗柱子后，取一无菌15 ml离心管（该离心管标号为）置于macs磁珠分离磁铁下，将细胞悬液缓慢加入柱子，用分选buffer 洗三次柱子（500ul/次，依次加入），将柱子从分离器上取下，置于另一无菌15 ml离心管（该离心管标号为）上，在柱子中加入1ml分选buffer，立即用活塞

48、将液体推出。此时号离心管中为bmnccd8细胞，悬液体积为2ml，将其置于4冰箱中备用。号离心管中为带有磁珠的cd4细胞悬液，体积为1ml，离心，彻底吸弃上清，用80ul分选buffer重悬细胞，加入macs释放试剂（每107细胞加20ul），混匀后48孵育10分钟，用分选buffer洗一次(分选buffer 1-2ml/107 cell)，离心，转速300g，离心10min，彻底吸弃上清。加入60ul分选buffer重悬细胞，在细胞悬液中加入10ul anti-pe microbeads，该磁珠同二抗anti- hcd57末端标记物pe结合，加入macs终止试剂（每107细胞加30ul），混

49、匀后48孵育15分钟，洗涤细胞一次，彻底吸弃上清，用500ul分选buffer重悬细胞，在cd8细胞中进行cd57细胞分选， 10操作同cd8细胞分选。最终得到bmnccd8cd57细胞悬液4ml，取1ml细胞悬液进行后续实验。将在4.8106bmnc中分选出的cd8cd57加入同一患者1.2106bmnc中，37恒温水浴孵育4小时，以备进行后续实验。 bmnc接种及集落测定 下述操作均按r&d公司提供的操作手册进行。将上述bmnc-cd8cd57及bmnc+cd8cd57细胞悬液离心，300g10min，彻底弃上清，在cell resuspension solution（r&

50、d公司产品，货号390397）中重悬细胞，充分混匀后将重悬细胞分别接种于human methylcellulose complete media中(hsc003，r&d公司产品，货号390395)，充分混匀，静置30分钟以上，让气泡充分逸出。将上述细胞同甲基纤维素的混合物分别接种35mm培养皿中，一式3份，每个培养皿中接种4105个细胞，置于37恒温孵育箱中，5%co2饱和湿度培养14天后，在倒置显微镜下计数细胞集落并拍照。大于40个细胞认定为集落，大于4个而小于40个细胞认定为集簇。计数毕，收集细胞，溶血试剂处理后，计数细胞，取少量细胞制成有核细胞涂片，自然干燥后密封，置于-24保存待检。

51、23 结果 231 mds病人与正常人bmnc剔除cd8t细胞后培养结果 50例初发低危mds患者在骨髓中剔除活化的cd8细胞（cd8cd57阳性）培养后，27例有集落及集簇生成(见图1-1)，mds患者红系集落平均为32个/4105细胞，粒系集落平均为191.4个/4105细胞；加回cd8cd57t（4倍）的bmnc培养后，均无集落集簇生成，培养基中为存活的单个细胞。8例仅见集簇生成（见图1-2），平均为101.1个。15例剔除活化cd8细胞培养后细胞生长较加回抑制因素者更为密集。正常对照组剔除cd8cd57t及加回cd8cd57t（4倍）的bmnc培养后，均有集落生成，红系集落平均为97个

52、/4105细胞和73.8个/4105细胞，粒系集落平均为327个/4105细胞和283.8/4105细胞，（见图1-3，图1-4），差异无统计学意义。5例治疗后复查病人，治疗后剔除活化t细胞培养可见细胞集落集簇生长，而治疗前均未见明显集落集簇生长。治疗后加回抑制因素亦可见少量细胞集簇生长，与治疗前加回抑制因素未见集落集簇生成有显著差异。 11 图1-1：mds患者剔除cd8+cd57+t的bmnc 图1-2：mds患者加回cd8+cd57+（4倍） 培养后集落生长情况 1010倍 bmnc培养后集落生长情况 1010倍 图1-3：正常对照剔除cd8+cd57+t的bmnc 图1-4：正常对照加

53、回cd8+cd57+（4倍）的 集落生长情况1010倍 bmnc培养后集落生长情况 1010倍 图1-5:mds患者bmnc去除cd8cd57双阳性t细胞后培养集落集簇形成情况 12 图1-6: 正常对照bmnc去除cd8+cd57+t细胞后培养集落集簇形成情况 24 讨 论 骨髓增生异常综合征（mds）患者常伴有免疫系统功能紊乱、出现自身免疫性疾病、淋巴细胞数量增加、骨髓及外周血淋巴细胞的极化状态发生改变等。已有研究显示，mds患者骨髓中t淋巴细胞向型极化方向偏移，活化的th1细胞分泌ifn-及tnf-a增多，通过fas及trail途径使低危mds残存的正常造血干细胞发生凋亡，致使无效造血、

54、发生骨髓衰竭。17 cd8cd57双阳性t细胞在骨髓和其他器官移植术后、类风湿性关节炎及aids 患者常可见升高，cd57常被认为是活化ctls的表面标志。本实验中采取cd8cd57双阳性t淋巴细胞来作为活化ctls，并在体外用磁珠分选技术将cd8cd57阳性细胞剔除，将阳性组分作为抑制因素加回患者bmnc，同时与剔除阳性组分的bmnc在甲基纤维素半固体培养基中培养，14天后可见，在剔除阳性组分的bmnc中，27例初治病例（总50例）可见有集落集簇生长，8例仅见集簇生长，15例仅见细胞密集分布。而所有50例初治病例在加回阳性组分后均未见细胞生长。5例正常人bmnc，剔除双阳性t细胞和加回双阳性t细胞两组培养后均能见集落集簇生长。以上实验结果说明，mds患者体内的活化的ctls细胞即cd8+cd57+ t，作为抑制因素加回患者bmnc后，发挥抑制作用，抑制了体外mds造血干/祖细胞在半固体培养基中的集落形成能力。由此推断，在体内，激活的cd8t细胞对于mds患者骨髓中正常的或有分化能力的干祖细胞有抑制作用， cd8t细胞 13为主的免疫攻击在杀伤mds克隆细胞的同时，可能误伤正常克隆细胞，导致低危mds以外周血细胞的减少为主，发生骨髓衰竭。