植物基因工程操作论文

1、瓜叶菊 Mlo 基因片段的克隆摘要瓜叶菊(Pericallis hybrida B. Nord.)是菊科(Compositea)多年生草本植物，是元旦、 春节重要的观赏盆栽早春花卉， 具有广阔的开发前景和现实意义。 近年来， 白粉病( Powdery Mildew )逐渐成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。瓜叶菊白粉病的传统生物 防治方法不仅使病原产生抗药性， 还会造成成本增加和环境污染等问题。 因此， 利用基因工 程手段培育具有广谱抗白粉病的瓜叶菊种质资源具有非常重要的意义。Mlo 基因是一种新型的抗病基因， 可能参与瓜叶菊白粉病的调控过程。 它与显性 R 基因 控制的抗病基因不同，

2、 它是由单基因控制的隐性抗病基因， 具有非小种专化的持久抗性， 其 功能类似于G蛋白偶联受体 。Mio基因可能对细胞坏死具有负调控作用，即抑制细胞坏死，类似于其它突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，Mlo 基因突变为 mlo 基因后， 对细胞死亡的负调控作用被解除， 被侵染细胞可能更易死亡，由此引发广谱的抗病性。 任何感病的野生型都可以通过对 Mlo 基因进行诱变而获得抗性。这种抗性，即便是在粗放的栽培管 理条件下，也可以在田间得到持久保存，即便没有病原菌的侵染，突变的mlo 植物也表现出自身细胞壁加固(cell wall appositions，CWAs)和叶细胞的自发死亡现象。因此，对

3、该基 因的克隆以及结构和功能的研究，为瓜叶菊的抗病育种奠定了基础并提供了新思路。本研究以瓜叶菊( Pericallis hybrida B. Nord. )为试材，通过 PCR 方法克隆了 Mlo 基因片 段的 cDNA 序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能和表达情况提供了理论依据。关键词 : 瓜叶菊； Mlo 基因片段； PCR 扩增；1. 研究的目的及意义在温室生产的条件下， 白粉病( Powdery Mildew )逐渐成为瓜叶菊 ( Pericallis hybrida B. Nord. )栽培的主要病害，发病后严重影响瓜叶菊的生长发育和观赏

4、性能，随着元旦、春节 人们对于盆栽早春瓜叶菊需求的逐年增加， 目前瓜叶菊白粉病已成为制约瓜叶菊商品化产业 发展的重要病害之一。迄今为止 , 化学杀菌剂的喷施是目前防控瓜叶菊白粉病的主要手段， 但又往往损伤叶片和花朵，影响了观赏价值和带来环境污染1 。在生产上，主要通过常规杂交选育的方法培育抗白粉病的瓜叶菊品种， 可是由于白粉病原菌优势小种的更替及突变速度 快，导致抗病选育往往落后于小种更替 2。近年来，人们采用 RNA 干扰 MLO ( Mycoplasma-like Organism) 基因技术进行白粉病的防治取得一定进展3,4，如果该技术应用于瓜叶菊白粉病的防治上，那么有望从根本上解决防控

5、白粉病的问题。瓜叶菊白粉病的 Mlo 基因防治机理认识还不是十分清楚，但是在大麦、番茄等作物上 有研究表明，作为一种新型抗病基因， Mlo 基因会使植物产生叶细胞的自发死亡现象，且在 抗性调控的过程中起负调控因子的作用 5,6 。即使没有病原菌存在时，携带mlo 突变基因的大麦也易引发植物本身自发性的细胞坏死，说明在细胞坏死过程中，野生Mlo 基因可能起负调控作用，即抑制细胞坏死 7,8 。通过缺失或移码的方式， Mlo 基因突变成为 mlo 后，正 常功能的 MLO 蛋白不能被合成，因此解除了这种负调控作用，而植物的叶表皮细胞会积累 具有抗真菌活性功能的酚类物质以及H2O2和。2，其中H2O

6、2能够直接杀死感病细胞和侵染的病原菌，从而阻碍了白粉病的入侵，并加固细胞壁，产生广谱抗病性 9,10 。本实验以瓜叶菊 ( Pericallis hybrida B. Nord. )为试材， 采用 RT-PCR 和 RACE 方法克 隆了 Mlo 基因 cDNA 全长序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研 究瓜叶菊 Mlo 基因的功能和获得具有广谱和持久的白粉菌抗性的瓜叶菊种质资源奠定基础。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 植物材料瓜叶菊( Pericallis hybrida B. Nord. )由东北农业大学园艺实验站提供， 取样液氮速冻保 存于-80 C冰箱中备

7、用。2.1.2 实验试剂TRIZOL 购自 Invitrogene 公司；总 RNA 抽提试剂盒购自北京天根；第一链 cDNA 合成 试剂盒， PCR 扩增试剂盒， DNA 凝胶回收试剂盒均购于北京全式金公司，其它生化试剂均 为进口或国产分析纯产品。2.1.3 菌株及载体大肠杆菌(E. coli)菌株Trans5a、TransT1购置于北京全式金， 克隆载体pMD18 T-Vector 购置于 TaKaRa 公司。2.2 实验方法2.2.1 瓜叶菊 Mlo 基因片段的克隆及序列预测分析 瓜叶菊 RNA 的提取方法一： TRIZOL 法提取 RNA( 1)剪取 100200mg 新

8、鲜的瓜叶菊叶片， 液氮研磨后， 置入 1.5ml 离心管中， 加入 lm1 预冷的 TRNzol Reagent 试剂，振荡 lmin ，室温放置 510min ；(2) 4C, 12000r/min，离心 10min，去除沉淀；( 3)取上清， 并将其液移入一新的离心管， 加入等体积的氯仿 ( 1:1 )，剧烈振荡 30sec， 室温静置 23min ；(4) 4C, 12000r/min，离心10min;样品分成三层：黄色有机相，中间层和上层无色 的水相， RNA 主要在水相中，把水相转移到新的离心管中；( 5)加入等体积的异丙醇,室温沉淀1030min；(6) 4C, 12000r/mi

9、n，离心 10min，沉淀 RNA ;(7) 去上清，加入Im175%的乙醇(DEPC处理过的水配制)清洗， 4 C, 7500r/min , 离心5min ;重复一次；室温晾干 10min左右；(9)加入50 无RNase的灭菌双蒸水(ddH?。)，溶解RNA ；( 10) 260mn 下测 OD 值定量 RNA 浓度； 方法二：参照北京天根总 RNA 抽提试剂盒说明书 设计简并引物将 GeneBank 上登录的外源植物 MIo 基因的核苷酸及氨基酸序列进行下载,通过 DNAMAN 软件进行序列比对,根据比对结果为上下游引物确定两个合适的保守区域,使用 primer5.0 设计

10、简并引物。221.3 RT-PCR扩增目的片段参照北京全式金 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix, 反转录试剂盒说明书。(1 )瓜叶菊 cDNA 第一链的获得 反转录反应体系如下：瓜叶菊 RNA3 uIAnchored Oligo(dT) 18(0.5 卩 g/ )卩11 ul2 XTS Reaction Mix10 ulTransScript RT/RI Enzyme Mix1 ulRNase- Free Water to20 ul反转录反应条件如下：42C 30min , 85C 5min 。 ( 2) Mlo 基因的 PCR 扩

11、增PCR 反应体系如下：TemplateDNA2 ulForward Primer(10 pM)1 ulReverse Primer(10 pM)1 ul10 TransTap HiFiBuffer5 ul2.5mM dNTPs4 ulTMTran sT ap HiFi DNA Polymerase ddH2O to fin al volum0.5 ul50 ul94 Cpause94 C3 min94 C30 s51 C1 min72 C1 min72 C10 min4Cpause反应结束后，进行琼脂:35 Cycles,利用紫外凝胶成像系统进行拍照及分析,观察是否PCR反应条件如下：扩增出

12、目的片段大小的条带。凝胶回收目的片段按照TIANgel Midi Purification Kit(离心柱型)胶回收试剂盒说明书进行。(1 )柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500卩1平衡液BL , 12000rpm离心1min，弃收集管中的废液，然后把吸附柱放回收集管中。(2) DNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，紫外灯下从凝胶上将目的条带DNA切 出放入干净的1.5ml Eppendorf管中称取重量。(3) 向胶块中加入3倍体积PN溶胶液(如凝胶重 0.1g，其体积可视为100卩1依此类推)， 50C水浴放置10min，期间不断上下翻转离心管，

13、确保胶块的完全溶解。如果胶块没有完全溶解，可再加入些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块彻底融化。(4) 将融化的胶溶液转移到一个吸附柱CA2中，室温放置2min , 12000 rpm离心3060s, 弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。(5) 向吸附柱 CA2中加入600 漂洗液PW。12000 rpm，离心3060s后，倒掉收集管中 的废液。(6) 将吸附柱CA2放回收集管中，12000 rpm ,离心2min ,尽量去净漂洗液，将吸附柱CA2 置于室温放置数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。(7) 将吸附柱CA2放入干净的离心管中，向吸附膜中央位置悬空滴加适量洗脱缓冲液

14、EB(6570C预热后效果更好)，室温放置2min。12000 rpm ,离心2min收集DNA溶液(洗 脱液体积应不少于 30卩)。回收DNA可立即使用或保存于-20 C备用。(8) 1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。 PCR产物与T载体连接pMD18-T Vector，在10 连接体系中加入以下成分： 表2-1连接反应体系Tab.2-1 The reacti on system of connect成分10卩管PCR回收产物4 ulpMD18-T Vector1 ulSolution I5 ul置于冰上操作，之后放于 16 C反应过夜。221.6连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(

15、Trans5 a Chemically Compete nt Cell )购于TRANS。操作说明如下：(1) 取感受态细胞100门 置于冰上融化，加入10卩l pMD18-T Vector连接产物，轻轻混匀， 冰浴30min。(2) 于42C水浴中热激90s，之后迅速将管移到冰浴中2min，该过程不要剧烈摇动。(3) 向每个离心管中加入 500无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于 37C, 200 r/min培养1h,使细菌复苏。(4) 8000rpm离心5min，留50-1001菌液，将感受态均匀涂开，将平板倒置于37C培养 箱中过夜。重组质粒的PCR鉴定在25 1

16、的PCR反应体系中，取模板为0.2 的质粒CDNA或1 的菌液，进行正常程序的PCR反应，同时设负对照，电泳检测是否扩增出特异条带。重组质粒的酶切鉴定本实验中用 Hind III单酶切、EcoRI单酶切和HindIII/ EcoRI双酶切来对重组质粒进行酶 切鉴定。观察电泳中 DNA条带位置，来确定是否有外源片段的插入以及插入片段的大小是 否正确，从而初步判断是否为重组克隆。然后将其送到华大基因进行测序。序列分析将测序所得的序列利用生物学软件进行分析，并通过NCBI网站()对Mio基因的序列信息进行解析。3结果与分析3.1瓜叶

17、菊总RNA的提取及质量分析采用TRIZOL法和试剂盒提取瓜叶菊叶片总RNA , 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。从图3-1可以清晰地看到 28S和18S两条主带，5s条带亮度也较弱，说明提取的总 RNA纯度较高，无明显降解，其完整性符合试验要求，可用于进行下一步反应。* 28S rRNA pi8S rRNA 5SrRNA图3-1瓜叶菊叶片总RNA3.2 Mlo基因保守序列的克隆3.2.1简并引物的设计在GenBank上搜索外源 Mlo基因的氨基酸序列，以番茄、辣椒、芜菁、拟南芥等植物为参考，使用DNAMAN软件对其氨基酸序列进行比对，结果发现该基因保守性较高，根据比对结果为上下游引物确

18、定两个合适的保守区域，使用primer5.0设计简并引物。克隆瓜叶菊Mio基因保守序列，简并引物序列为：F: 5 -CAYCARCTGCAY ATHTTCA T-3R: 5 -GGVAGAGTCACA TAGCTGCA- 33. 2.2 RT-PCR扩增Mio基因目的片段* 812bp以瓜叶菊总RNA反转录所得到的第一链 cDNA为模板，PCR扩增目的片段，扩增产物 经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现约在812bp处有一条亮带，与目的片断的大小一致（图3-2）， 初步推测该扩增产物为 Mio基因目的片断，并有待进一步鉴定。2000bp looobp 75Obp图3-2 Mio基因的RT-PCR扩增

19、电泳图M : DL2000 ； 1： Mio 基因片段3. 2.3阳性克隆的筛选与鉴定将经回收、纯化后的 PCR产物与pMD18-T Vector载体连接，连接产物转化大肠杆菌 Trans5 a感受态细胞后，在含有100 mg/L Amp的固体LB培养基上进行筛选。 为确保证实验 的准确性，设立了两种对照，即为：阴性对照和阳性对照，以大肠杆菌感受态细胞涂抹不加任何抗生素的LB培养基上作为阳性对照，结果长满菌落，说明感受态细胞有效，可用于转 化；以感受态细胞涂抹于100mg/L Amp的固体LB培养基上作为阴性对照，结果没有菌落长出，说明抗生素有效。挑取阳性克隆进行 pCR扩增，得到的扩增片段大

20、小约为812bp（图3-3）,与RT-PCR结果一致，表明这些克隆为阳性克隆。2G00bp1000bp750bp图3-3重组质粒的PCR鉴定电泳图M : DL2000 ; 1:阴性对照；2-5: 4个阳性克隆的 PCR鉴定3. 2.4阳性克隆的酶切鉴定挑取白色菌落进行酶切鉴定。利用pMD18-T Vector载体上位于插入位点两端的Hindill和EcoRI酶切位点，用 HindHI单酶切、EcoRI单酶切和Hindlll/EcoRI双酶切对其进行酶切鉴定，结果见图3-4。2000bp1000bp750bpM 1234* 812bp图3-4酶切鉴定M : DL2000 ； 1:阴性对照；2：

21、Hi nd HI 单酶切；3： EcoRI 单酶切；4: Hi ndHI/EcoRI 双酶切4.2.5瓜叶菊Mio基因片段的序列分析将重组pMD18- T质粒经过PCR鉴定后，将确定的阳性克隆进行测序，得到一段长度为812 bp的序列，编码267个氨基酸（图3-5，3-6）。Blast比较结果显示：该序列与其他植物 的Mio基因核苷酸序列的同源性均在72%以上，氨基酸序列的同源性达82%以上。表明所克隆到的片段为 Mio基因片断。1心哉tgtfittsgcrt gtettl cat gtcattgt at tct tH QLHIFIFV L A V F H V I YC I L61 act t

22、it saltac a ag at ga ag t gg a. ag cd: at g aaac aaafI LILGRLKM R K W K A W E DE T K121 acagt gaat accaat accacaacgart c cagaaagarttt cgarttt gcaagagagacgact TVEY Q YH NDPERFRFARETT 181 t tt g gt cgcagacartagattt t gg.ageaact caacaatt ct: ctl art ggattgett ccF GRRH LRFWS NSTI LLWIA S24 1 11111cagac

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26、MGVV781 atacagt tt at at gcagct at gtgact ct c匚 8 121 Q F I C S Y V T L图3-5瓜叶菊Mio基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列瓜叶菊5EQ 拟南芥.MQ 躱梅5EQ 番茄.5EQ Cansemsus瓜叶.SEQ 拟南芥5即 探椒.SEQ 番Sfl.SEQConsensus瓜叶菊5EQ 拟箜芥.SEQ 詠椒.5EQ SS.SEQCorLserLBQB瓜叶.SEQ 拟南芥SEQ .SEQ 番茄.5EQ匚 onsensusHfiLHIFTFVL HCLHIFIFVL. HGLHIFIFVL HLHIFIFVL.攣暫:理督ng

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29、offylw pvlf nafq aff ws fGS：?：PSp=iCFiCF!CF.|ES片RNA：沁cfhgv-.fj gv-.fl E坤 gLAQd iq csvvtliRfi vSlL 1!vHCSYVT csyvi CSTVTCSYVT图3-6 Mio基因氨基酸序列比对结果参考文献1 文U继成，张玉英，李小燕瓜叶菊主要病虫害及其防治J.现代园艺，2010(2): 43-44.2 李振岐，韩德俊,曹莉.大麦抗白粉病 Mio基因的研究进展 J.西北植物学报，2003,23(3): 496-502.3 HERNANDO A， GIL-HUMANES J， ALV AREZ J B， SH

30、EWRY P R， BARRO F. Siiencing of g-giiadins by RNA interferenceI(RNAi) in bread wheatJ.J Cereai Sci， 2008， 48:565-568.4 UMESH BALKRISHNA JAGTAP， RANJIT GAJANAN GURAV， VISHW AS ANANT BAPAT.Roie RNA interference in piant improvement J.Naturwissenschaften， 2011， 98:473-492. 胡东维，罗臻，张敬泽.大麦Mio近等基因系与叶枯病菌互作的