扶正化淤方对四氯化碳肝纤维化大鼠基膜型基质金属蛋白酶活性的影响

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减扶正化淤方对四氯化碳肝纤维化大鼠基膜型基质金属蛋白酶活性的影响（作者：单位：邮编：）作者：崔红燕，刘成海，孙保木，刘成【摘要】目的探讨扶正化淤方通过影响基膜型基质金属蛋白酶活性而抗肝纤维化的作用机制。方法四氯化碳（CCI4）皮下注射与高脂 低蛋白饲料复合建立大鼠肝纤维化模型。随机分为正常组、模型组与扶正化淤方药物干预组。药物组自造模之日起以扶正化淤方稀释液灌 胃，共用药6周。HE染色观察肝组织炎性病理变化，天狼猩红染色 观察肝组织胶原沉积，盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸含量，Western印迹法分析肝组织a -SMA、W型胶原、MMP-2、MMP-9、TIMP

2、-2和MT-MMP1蛋白表达水平；明胶酶图法检测肝组织 MMP-2/9活性。结果与正常大鼠比较，模型大鼠血清肝功能异常、 肝组织炎症明显、肝组织IV型胶原表达与沉积增加，a -SMA、W型 胶原、MMP-2、MMP-9、TIMP-2和MT-MMP1蛋白表达升高，而 MMP-2/9活性水平明显上升。扶正化瘀方显著改善模型大鼠血清肝 功能、减轻肝脏炎症和胶原沉积；减少肝星状细胞活化；抑制W型胶原蛋白表达和沉积；降低 MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP蛋白表达； 抑制MMP-2/9活性。结论扶正化瘀方可通过抑制MMP-2的激活与活性水平，并减少W型胶原沉积，而起到减轻肝组织的破坏与重构而 发挥

3、抗肝纤维化的作用。【关键词】扶正化淤方基质金属蛋白酶基膜型肝纤维化Abstract : ObjectiveTo investigate the effects of Fuzheng Huayu recipe (FZHY recipe) on the activity of membrane-type matrix-metalloproteinasesand its mechanism in the treatment ofliver fibrosis. MethodsLiver fibrosis was in duced in rats by injectio n of CCI4 subcut

4、aneously and fed with high lipid and lower protein diet. Rats were ran domly divided in to 3 groups : no rmal , model control and Fuzheng Huayu decoction treated group. For the treated group , rats were administered with Fuzheng Huayu decoction by gavage for 6 weeks. Inflammationin liver wasMMP-2/9

5、, TIMP-2 anddeterm ined by HE sta inin g,Collage n depositi on in liver was studied by Sirius red staining,the content of hepatic hydroxyproline(Hyp) were measured with Jamall methods; protein expressions of a -SMA, collagen IV, MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 were tested by Western blot, and MMP-2/9 activi

6、ties were analyzed by gelatin zymography.ResultsCompared with normal group , abnormal liver function, obvious hepatic inflammation, excess collagen deposition, high prote in expressi ons of collage n IVMT1-MMP, and in creased activities of MMP-2/9 were observed in model group. Compared with model gr

7、oup, FZHY recipe sig ni fica ntlyimproved the rat liver fun cti on,alleviated liverinflammation and the excess collagen depositionn addition, it also significantly down-regulated the protein expression of collagen IV , MMP-2, TIMP-2 and MT1-MMP, and inhibited the activity of MMP-2.Con clusi on Fuzhe

8、 ngHuayu decocti on can dow n-regulate theactivities of MMP-2 /9 and inhibit the activation of MMP-2 , reduce the excess collagen IV deposition in liver tissue, and to alleviate the damage and rege neratio n of liver.Key words : FZHY Decoction ; MMP ; Membrane-type ; Liver Fibrosis肝纤维化是诸多慢性肝病的共同病理特点

9、，以肝脏细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)代谢失衡，生成超过降解，并大量沉积 于肝组织为特征。基质金属蛋白酶( matrix metalloprote in ases ， MMPs )在ECM降解与肝纤维化逆转过程中起重要作用。扶正化瘀 方具有良好的抗肝纤维化的疗效，其机理包括抗肝细胞脂质过氧化损 伤、抑制肝星状细胞活化等1，2。既往我们也曾报道该方对间 质性MMPs活性的影响3。本研究制备CCl4肝纤维化模型，旨 在探讨扶正化淤方通过影响基膜型MMPs活性和酶原活化调节因子而抗肝纤维化的作用机制。1材料1.1动物Wistar雄性大鼠33只，清洁级，体重(150

10、0)g，中科院上海 实验动物中心提供，上海中医药大学实验动物中心清洁级饲养。1.2药物扶正化淤方由丹参、桃仁、虫草菌丝、松黄粉、五味子、绞股 蓝组成，浸膏干粉由上海现代中医药技术发展公司提供，制备成含 276 mg生药ml-1的流浸膏灌胃液。1.3试剂四氯化碳(CCI4)分析纯，购自上海华东试剂公司。羟脯氨酸 (hydroxyproli ne. Hyp)标准品，分析纯，日本扌力株式会 社产品。小鼠抗人a -平滑肌肌动蛋白(a-SMA)单克隆抗体，Dako公 司产品。兔抗人MMP-2多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程公司。小鼠抗人 MMP-9和金属蛋白酶组织抑制物-2 (tissue inhib

11、itors of metalloprote in ase-2 ，TIMP-2 )单克隆抗体、小鼠抗人W型胶原单克 隆抗体，美国NeoMarker公司产品。小鼠抗人膜型基质金属蛋白酶 -1 (membra ne type-1 matrix metalloprote in ases ，MT1-MMP ) 单克 隆抗体，Chemicon公司产品。辣根过氧化物标记驴抗兔抗体和辣根 过氧化物标记驴抗鼠抗体，美国Amersham Pharmacia Biotech 公司 产品。化学荧光底物(ECL)为Pierce公司产品。明胶，美国Amersco 公司产品。2方法 2.1模型制备首次皮下注射100 % C

12、CI4溶液0.5 ml /100 g，其后40 % CCI4 橄榄油溶液0.3 ml /100 g , 2次/d，共6周。第12周给予高脂低 蛋白饲料（79.5 %玉米粉、20 %猪油、0.5 %胆固醇），而后给予纯玉米 饲料。正常对照组皮下注射等量橄榄油，普通饮食。2.2分组用药大鼠分为正常组（5只）、模型组（13只）与扶正化瘀方药物干 预组（15只）。药物干预组灌胃扶正化瘀方药液，以10 ml /kg大鼠体 重（相当于65 kg等体重成人等效量）的剂量，自造模之日起，1次/d， 共用药6周，其余两组灌同容积的生理盐水。2.3肝脏组织病理学观察HE染色和天狼猩红胶原染色，光镜观察。2.4血清

13、肝功能测定试剂盒方法检测血清 ALT活性、AST活性、Alb和TBil水平。2.5肝组织Hyp含量测定盐水水解法，参照Jamall氏法4 。2.6 肝组织 a-SMA、W型胶原、MMP-2、MMP-9、TIMP-2 和 MT-MMP1蛋白表达采用 Western印迹法。 取100 mg肝组织加裂解液（0.15mol / L NaCl，1%NP-40，1% SDS，50 mmol / L Tris pH 7.2，5 mmol /L EDTA，1 mmol /L PMSF）4 C匀浆。12 000r /min 离心 10 min， 提取肝组织总蛋白，考马斯亮蓝试剂盒（南京建成）测定总蛋白含量。取5

14、0总蛋白，变性后进行10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋 白转移至硝酸纤维素膜，经5 %脱脂奶粉/ TBS溶液封闭后，分别加 入以下特异性抗体：分别与a -SMA (1 ：00 )、W型胶原(1 100 )、 MMP-2 (1 133 )、MMP-9 (1 100)、TIMP-2 (1 100)、MT1-MMP(1 100)抗体4C孵育过夜，洗涤后以偶联 HRP的抗小鼠抗体(1 : 5 000)结合，ECL显影曝光。每组至少重复3次实验，计算机扫描， 图像分析软件半定量目的蛋白表达水平。2.7肝组织MMP-2/9活性检测采用明胶酶图法5。取100 mg肝组织置0.9 ml匀浆缓冲液(1 m

15、ol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCI, pH7.0)中匀浆。取含 30 总蛋白的匀浆液进行含0.1%明胶的8% SDS-PAGE还原但非变性电 泳。电泳结束后，凝胶置于洗脱液(2.5%Triton X-100, 50 mmol/L-Tris-HCI, 5 mmol/L CaCl2, 1gol/LZnCI2，pH7.6 )中洗脱2 次，45 min/次;再以漂洗液(50 m mol/L Tris-HCl, 5 mmol/L CaCl2, 1呵ol/L ZnCl2, pH7.6 )漂洗2次，30 min/次。其后，将凝胶置于孵 育液(50 mmol/L Tris-HCl, 5

16、 mmol/LCaCI2, 1gmol/L ZnCl2, 0.02%Brij-35, pH7.6 ) 中 37 C孵育18 h。孵育结束后经考马斯亮蓝染色液 染色，可显示出MMP-2和MMP-9位于蓝色背景上的透亮带。电泳 凝胶在灰阶模式下扫描，应用复日FR-980生物电泳图象分析系统测 定凝胶中的MMPs活性条带。2.8统计学方法计量资料用士 s表示，计算机统计软件SPSS 11.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，P0.05为具有显著性差异。3结果3.1扶正化瘀方对模型大鼠肝脏炎症与纤维化的影响病理组织染色发现，与正常组比较，模型大鼠可见大面积出血 性坏死并见大量肿胀肝细胞，汇管区明显

17、增宽并有炎性细胞浸润， 肝 小叶结构紊乱；胶原纤维胶原沉积增多，纤维间隔和假小叶形成。生 化检测发现模型组大鼠肝组织Hyp水平较正常组明显升高；血清ALT、AST活性、TBil与Alb明显升高。与模型组比较，扶正化瘀方 组大鼠肝组织炎性细胞浸润与坏死明显减轻，胶原纤维沉积减少；肝组织Hyp含量显著降低；血清 ALT、AST活性有显著下降，TBil与 Alb变化不明显。结果见表1。表1扶正化瘀方对模型大鼠血清肝功 能和Hyp含量的影响（略）与模型组比较，* P v 0.05, * P v 0.013.2扶正化瘀方对模型大鼠a -SMA蛋白表达的影响模型组大鼠肝组织a -SMA表达明显增加，而扶正

18、化瘀方用药后，a-SMA表达基本下降至正常水平（见图1）。3.3扶正化瘀方对模型大鼠W型胶原蛋白表达的影响与正常组比较，模型组大鼠肝组织IV型胶原表达明显增加，而扶正化 瘀方明显降低模型大鼠肝组织异常升高IV型胶原蛋白的表达（见图2）。3.4扶正化瘀方对模型大鼠 MMP-2/9蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组 MMP-2蛋白表达变化略有升高，MMP-9蛋白表达显著升高。与模型组相比，扶正化瘀方对纤维化肝脏的MMP-2表达有所下降，而MMP-9蛋白表达变化不明显（见图3）。3.5扶正化瘀方对模型大鼠肝组织 MMP-2和MMP-9活性 的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝组织 MMP-2和MMP

19、-9活性明 显升高。扶正化淤方治疗组显著降低模型大鼠肝组织MMP-2和MMP-9活性，对MMP-9活性影响更为明显（见图4）。3.6扶正化瘀方对肝组织TIMP-2蛋白表达的影响 与正常组比 较，模型组大鼠肝组织TIMP-2蛋白表达明显升高，扶正化瘀方组明 显减少模型大鼠肝组织的TIMP-2蛋白表达（见图5）。3.7扶正化瘀方对肝组织 MT1-MMP蛋白表达的影响模型 组大鼠肝组织 MT1-MMP蛋白表达均较正常组明显升高。扶正化瘀 方用药后，大鼠肝组织 MT1-MMP表达有所下降（图6）。4讨论基膜性MMPs包括MMP-2和MMP-9，主要降解基底膜的重要成 分一一天然W型胶原、明胶（变性的间

20、质性胶原）和V型胶原，从而 直接参与调节ECM的合成与降解的动态平衡，与肝纤维化发生、发 展密切相关。既往研究表明6,7,肝纤维化早期，MMP-2和MMP-9 活性升高，降解窦周间隙W型胶原，破坏基底膜正常结构，启动了肝纤维化的发生；而对于肝纤维化形成过程中基膜性MMPs表达持续升高，认为其意义则在于参与降解过度沉积的胶原及促进肝纤维化的 逆转。然而近年来对 MMP-2在肝纤维化中的作用又有了新的认识， 研究发现肝脏MMP-2主要来源于肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)，而肝细胞的过氧化损伤可通过 ERK/PI3K等信号途径，上调 MMP-2活性，从而促进HSC

21、的增殖活化与迁移8。我们也曾动 态观察肝组织 MMP-2活性9，发现MMP-2活性与肝脏炎症、 HSC活化密切相关，变化趋势一致。这说明肝纤维化时MMP-2活性升高主要由于炎症刺激与HSC活化，并非仅仅是机体对纤维增生 的一种反馈性调节机制，而 MMP-2活性的升高又可进一步促进正常 基膜成分的降解，破坏正常肝组织结构，促进 HSC活化，导致肝脏 结构重构与纤维化形成。肝纤维化时 MMP-2活化和HSC活化互为 因果，形成恶性循环，共同促进了肝纤维化的进程。本实验发现CCI4 模型大鼠肝组织MMP-2/9蛋白表达和活性显著升高，HSC活化标志 物a-SMA表达也明显增高，而用扶正化瘀方后可显著

22、抑制MMP-2/9的活性水平并减少HSC的活化，提示该方可通过抑制MMP2/9活性 而防止肝组织正常基膜结构的破坏，阻止肝组织结构重构以及肝纤维 化的进一步发展。TIMP-2和MT1-MMP在MMP-2活性调节中具有重要作用10 MMP-2酶原激活首先要形成 MMP-2、MT1-MMP和TIMP-2三联体 复合物才能进一步活化。TIMP-2对MMP-2作用较为复杂，高浓度 时抑制MMP-2的活性，低浓度时则通过与 MT-MMP1结合而促进MMP-2酶原的活化。本研究发现，造模组 TIMP-2和MT1-MMP蛋 白水平均显著升高，这可导致模型大鼠MMP-2激活增多，活性升高； 而扶正化瘀方可使二

23、者表达明显下降，应该是通过减少了三联体复合 物的形成而起到抑制MMP-2活性的作用。W型胶原是MMP-2/9的底物，既然在肝纤维化过程中 MMP-2/9 活性升高，那么W型胶原理应减少。其实在肝纤维化过程中，由于 HSC过度增殖活化，W型胶原生成增多，超过降解，在肝脏中异常 沉积，与增生的间质性胶原共同参与了肝纤维化的进展过程。我们既往经免疫组化染色发现二甲基亚硝胺肝纤维化模型肝组织中肝窦及 小叶W型胶原蛋白表达均明显增加11 ，蛋白印迹法也进一步证实 W型胶原蛋白在肝纤维化过程中表达增加。本实验应用CC14造模，经蛋白印迹法检测亦发现，肝纤维化形成过程中W型胶原蛋白表达显 著升高，其变化与a

24、 -SMA表达水平和肝脏总胶原沉积变化相同，即 与肝纤维化程度一致。扶正化瘀方能明显抑制W型胶原表达，可能是由于该方能够抑制HSC的活化，而HSC是W型胶原的主要来源。总之，本实验发现扶正化瘀方可通过改善肝脏炎症、减少HSC活化与调节酶原活化因子表达而抑制 MMP-2活性水平，同时能抑制W 型胶原在肝脏的沉积，从而减轻肝组织的破坏与重构，这是扶正化瘀 方抗肝纤维化的重要作用机制之一。【参考文献】:1 刘成海，陈文惠，刘平，等.二甲基亚硝胺致大鼠 脂质过氧化变化与药物干预作用J.中华肝脏病杂志，2001, 9（增刊):18.:2 宣红萍，孙保木，陶艳艳，等.扶正化瘀方对大鼠脂 肪性肝炎与肝纤维化的作用J.药品评价,2007, 4(6): 414.:3 崔红燕，姜哲浩，刘成，等.扶正化瘀方对肝纤维化 大鼠间质性基质金属蛋白酶活性的影响J.上海中医药大学学报， 2003, 17(3): 35.4 Jamall IS. A simple method to determ ine nano gram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues J . Analytical biochemistry, 1981, 112: 70.5