消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究(作者：单位：邮编：)【关键词】消化性溃疡幽门螺杆菌感染Toll样受体HP感染是引起人类慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病的病 因之一，但研究发现在HP感染者中仅有极少数会发生上述疾病。HP 致病机制与细菌数量、毒力以及环境因素、宿主易感性、胃肠黏膜内 环境等有关。人类TLR4通过识别病原相关分子构型(PAMPs),激活 先天性免疫应答机制，同时还诱导共刺激分子CD80的表达，为获得 性免疫的启动提供活化信号，因此在免疫系统中有着十分重要的作用:1。TLR4作为细菌脂多糖(LPS)的受体，将LPS

2、传导通路的信号 迅速传至核内，通过激活核因子-kB(NF-kB),刺激NO分泌，消灭病 原；还可促进炎性细胞因子表达与释放，激活特异性免疫反应2 本研究通过探讨TLR4基因突变与HP感染相关性消化性溃疡的关系， 旨在为阐明HP感染相关性消化性溃疡的遗传易感性和先天性免疫机制提供依据。1临床资料1.1 一般资料于2006年7月至2007年6月间，在温州医学院附属第二医院 消化内科，依据悉尼分类标准3收集消化性溃疡患者120例(胃溃 疡51例、十二指肠球部溃疡69例)。其中男72例，女48例；平均 年龄52.2岁。正常体检者204例作为对照组，男104例，女100 例; 平均年龄39.2岁。1.2

3、方法(1) 取外周静脉血5ml, EDTA抗凝，蛋白酶K/酚/氯仿法提取 基因组DNA。(2) PCR扩增目的基因，根据文献设计引物4如下。PCR反 应体系 25 山，每侧引物各 10pmol，dNTPs(10mmol/L)0.5 讥 DNA 聚合酶1U,DNA模板1讽约40-100ng)。反应条件：94 C预变性3min， 接着38个循环，94 C变性45s，51C复性45s，72 C延伸45s，72 C 终末循环5min，最后于4 C终止反应。PCR产物片段长度139bp或 131bp，用2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分析仪鉴定。TLR4 Asp299Gly 基因多态性分析：限制性内切酶消化 P

4、CR产物 酶切反应体系20山含10山 PCR()的产物，用BsaBI内切酶0.5 M(10U/山)，于55C消化酶切4h; 取10山PCR( D)的产物，用BstXI内切酶0.5山于65 C消化酶切 4h后80 C灭活20min ;酶切产物用8%的非变形聚丙烯酰胺凝胶 电泳(100V,1.5h)分离，1%。硝酸银染色分析基因型；基因测序：部 分PCR(及PCR(产物经纯化后由上海生工生物工程服务有限公 司进行DNA测序，测序样品作为阳性对照；消化性溃疡患者均采 用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定HP-IgG。同时采用胃窦黏膜组织快 速尿素酶试验（pH值指示剂法）,检测HP感染。诊断HP感染参

5、照安 徽桐城会议通过的共识意见5 , 2项均阳性诊断HP感染。正常体 检者采用14C-尿素呼气试验，检测HP感染，检测前所有研究对象均 未行抗HP治疗。1.3统计学处理SPSS 11.5软件处理试验数据，采用检验分析病例组和对照 组Asp299Gly基因型频率及等位基因分布的差异，以及分析TLR4基因Asp299Gly基因型与HP感染相关性消化性溃疡之间的关系。 P0.05有显著性差异。2结果浙江汉族人群中，TLR4基因Asp299Gly等位基因位点均为野 生型A,未见突变型G; A等位基因频率及AA基因型频率均为100%。 消化性溃疡组及正常对照组 TLR4基因Asp299Gly基因型频率，

6、等 位基因频率及携带者频率分布无显著性差异。TLR4基因Asp299Gly多态性与HP感染关系，消化性溃疡患 者中HP感染率为94.7%,正常对照为60.1%;两组中TLR4基因 Asp299Gly基因型频率，等位基因频率及携带者频率分布无差异，所 有研究个体均为AA纯合子。参照文献结果6，将汉族人群TLR4基因Asp299Gly多态性 与外国人群比较，发现 TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率存在种族差异。汉族人和日本人该等位基因均为野生型A,未发现突变型G;与荷兰咼加索人相比，等位基因频率及基因型频率具 有显著性差异。AA基因型频率在中国浙江汉族人(2=33.064 ,P

7、=0.000 ,OR=1.183 ,95%CI:1.080 1.296)及日本人群(率=42.682 , P=0.0001 , OR=1.183 , 95%CI:1.109 1.262)中显著高于荷兰人群； 而荷兰人群等位基因 A的频率明显高于中国人群(沱=37.403 ,P=0.000 ,OR=1.098 ,95%CI:1.047 1.151)及日本人群(率=42.597 ,P=0.000 , OR=1.125 , 95%CI:1.077 1.175)。由此可见中国及日本 人群与荷兰高加索人TLR4基因Asp299Gly位点多态性分布存在显 著性差异。3讨论TLR是人类在进化过程中所保留的参

8、与先天性抗感染的受 体蛋白家族，具有高度保守性。TLR不仅通过识别病原微生物的PAMP,激活先天性免疫反应，还诱导共刺激分子CD80的表达，为 获得性免疫的启动提供必要的活化信号，因此在免疫系统中有着十分 重要的作用。TLR超家族已发现有10个家族成员，其中TLR4、TLR2 与宿主的免疫功能有着密切联系，可识别不同的病原分子。TLR4主要作为革兰阴性菌LPS的特异性受体，在LPS诱导的信号传导中起 着重要作用，TLR2则主要作为革兰阳性菌的肽聚糖、酵母菌的甘露 聚糖及某些特定的LPS的受体。TLR4接触不同的抗原分子后，通过 协同分子CD14、LPS结合蛋白、MD2的共同作用，经由MyD88

9、、TIRAP/MAL等信号传导途径，将LPS传导通路的信号迅速传至核内， 激活NF- iB通道，刺激NO分泌，消灭病原菌；此外，激活相关细 胞因子的表达，释放炎症细胞因子，激活特异性免疫反应，因而在机 体的先天性免疫中起到十分重要的作用。Arbour等用单链构象多态 性分析法(PCR-SSCP)和基因测序的方法发现了 TLR4基因的非同义 的单核甘酸多态性 Asp299Gly和Thr399lle，除体外转染研究证实 Asp299Gly 多态性与LPS的反应减低有关外，Asp299Gly 和 Thr399Ile等位基因杂合子和纯合子个体与野生型基因型的个体相 比，吸入性LPS的气道反应明显减低。

10、小鼠C3H/HeJ和 C57BL/10ScCr株对LPS高度抵抗，缺乏先天性免疫的生物作用， 易受感染,是由于小鼠TLR4基因突变导致对LPS无反应，或LPS信 号传导异常所致。野生型 TLR4的表达增强可使LPS的信号增强。 研究发现TLR4基因的突变可改变肠黏膜先天性免疫细胞和肠上皮 TLR4分子结构，使机体的免疫系统失去正常处理肠腔内的大量细菌 和LPS等病原分子的能力，进而使肠黏膜在长期的刺激下产生感染、 炎症、过敏、易激乃至癌变。流行病学调查结果显示：人群中 HP感染率与其社会经济地位 关系密切， 发达国家成人 HP感染率40%,而我国人群感染率为 20%80%，明显高于经济发达国家

11、。本研究中，正常浙江汉族人群 HP感染率是60.1%,与以上的研究结果一致。同时已有大量研究资 料显示：HP感染率高的地区和国家人群的胃炎和消化性溃疡的发病率也较高，如经济落后国家同发达的欧美国家比较 ，HP感染相关性 胃炎和消化性溃疡的发病率也高。 通过对浙江汉族人群 HP感染的 检测，发现消化性溃疡患者组 HP感染率显著高于对照组(P = 0.000, OR=12.512,95%CI:5.25529.792)。本研究采用 PCR 限制性片段 长度多态性分析的方法，对120例消化性溃疡患者及204例正常对照 者TLR4基因sp299Gly基因型及等位基因分布进行检测，发现所有 样本均为野生型

12、基因型，提示在中国浙江汉族人群中罕见 TLR4基因 Asp299Gly突变基因型。树突状细胞(DC)是重要的抗原提呈细胞，在机体免疫应答过程中起着至关重要的作用。目前研究发现胃黏膜上皮DC能穿过胃 上皮细胞间的紧密连接，到达胃黏液层与HP接触7 , HP能够特 异性地定植于胃黏膜的黏液层下的上皮细胞表面；另发现在活体内胃 上皮细胞可以表达 TLR :8。国外Bauditz等9对HP感染相 关性胃炎进行研究，发现LPS引起胃黏膜单核细胞分泌大量IL-12, 在胃粘膜上皮细胞表达的 TLRs与HP的LPS相互作用后，通过 TLR4/CD14途径激活单核一巨噬细胞分泌细胞因子，如TNF- a, IL

13、-1, IL-6, IL-8等，引起胃黏膜的炎症。Su等10发现与临床相关的I 型HP禾叮型HP感染能激活TLR4基因的表达，Kawahara等11 发现I型HP的脂质A可以激活TLR4途径。本研究将汉族消化性溃 疡患者按HP感染分类后，未发现TLR4基因Asp299Gly突变基因型， 与正常对照组相比无显著性差异，提示TLR4基因Asp299Gly多态性与汉族HP感染相关性消化性溃疡的发生无相关性。本研究将中国浙江汉族人群与其他人种的TLR4基因的Asp299Gly多态性分布进行分析比较，发现不同人群中TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率的分布存在显著性差异。 其中 中国汉

14、族人与日本人的 Asp299Gly等位基因频率及基因型频率分布 无明显差异性，即在所检测的样本中均未发现 TLR4基因Asp299Gly 的突变基因型，与荷兰高加索人群突变频率存在明显差异，提示由于 欧亚人种在TLR4基因Asp299Gly等位基因及基因型频率分布的不 同，导致种族差异和遗传背景的不同，从而影响TLR4基因多态性在 消化性溃疡等疾病的遗传机制中的作用。另外由于CD14是TLR4信 号传导途径中重要的协同分子，CD14基因多态性在不同人种之间的 分布差异也可能影响TLR4在HP的LPS抗原呈递和胞内信号传导 过程中所发挥的作用。【参考文献】1 Akira S,Takeda K,K

15、aisho T.Toll-like receptors:critical protei ns lin ki ng inn ate and acquired immun ity.Nat.lm munol，2001，2:675 680.2 Chow JC, Young DW, Golenbock DT, et al. Toll-likereceptor-4mediateslipopolysaccharide-i nducedsig naltransduction. J Biol Chem ， 1999，274:10689 10692.3 Dixon MF, Genta RM, Yardley JH

16、, et al. Classification and grad ing of gastritis.The updated Sydney System .Intern ati onal Workshop on the Histopathology of Gastritis, Houston 1994. Am J Surg Pathol , 1996 , 20: 1161 1181.4 Okayama N, Fujimura K, Suehiro Y, et al.Simple geno type an alysisof the Asp299Gly polymorphism ofthe Toll

17、-like receptor-4 gene that is associatedwith lipopolysaccharide hyporesponsiveness. J Clin Lab Anal, 2002 ,16: 56 58.5 Consen sus on the man ageme nt of Helicobacter Pyloriinfection: Tongcheng, AnhuiProvinee, 2003. Chin J Dig Dis , 2004 , 5: 186 188.6蒋益，闵小彦,张定亮.Toll样受体4基因Asp299Gly多态性与溃疡性结肠炎及大肠腺癌.中华内

18、科杂志，2006,7(45):34.7 Scheinecker C, McHugh R, Shevach EM, et al.Constitutive presentation ofa natural tissue autoantigen exclusively by dendritic cells in the draininglymphnode. J Exp Med , 2002 , 196:1079 1090.8 Schmausser B, Andrulis M, Endrich S, et al.Expressi on and subcellular distributi on of toll-like receptorsTLR4, TLR5 and TLR9 on the