组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在胰腺癌耐药细胞株中的表达

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减组蛋白 HIST1H2AC 禾口 HIST1H2BC 基因在胰腺癌耐药细胞株中的表达（作者：单位：邮编：）【摘要】目的：研究组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC在培美 曲塞诱导的胰腺癌耐药细胞株 Puta8988中的基因和蛋白表达水平， 以明确HIST1H2AC和HIST1H2BCS因与胰腺癌耐药的关系。方法：以 两种剂量的培美曲塞诱导胰腺癌细胞株Puta8988,使其形成两个等级的获得性耐药细胞株 Puta8988+、Puta8988+。采用qRTUPCR和 Western blotting 方法分别检测 HIST1H2AC和 HIST1H2BC在

2、耐药细 胞株及其亲本（对照）中的基因和蛋白表达水平。结果：qRT拟.PCF检测 结果显示，组蛋白 HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在胰腺癌耐药株 Puta8988+和 Puta8988+ 中的表达水平显著上调 （P0.05）;Western blotting 检测结果显示，组蛋白 HIST1H2AC和HIST1H2BC在胰腺癌 耐药株 Puta8988+和 Puta8988+中的蛋白表达水平也显著上调 （P0.05）。结论：胰腺癌细胞株经培美曲塞诱导后，其组蛋白HIST1H2AC 和HIST1H2BC在基因和蛋白表达水平上均出现上调，提示 HIST1H2AC 和HIST1H2BCS因

3、可能与耐药有关。【关键词】HIST1H2AC; HIST1H2BC;胰腺癌；Puta8988;培美曲塞;表达Abstract Objective: To investigate the expression ofHIST1H2AC and HIST1H2BC genes in pan creatic can cer cell li ne Puta8988 treated with pemetrexed, and to verify the relatio nship betwee n the genes and pemetrexed 拟 resista nee. Methods: Pancre

4、atic cancer cell line Puta8988 was treated with two doses of pemetrexed to get Puta8988+ and Puta8988+ with pemetrexed 拟 resista nee,and the expressi on levels of HIST1H2ACand HIST1H2BCand their genes in Puta8988, Puta8988+ and Puta8988+ were detected by qRTlPCR and Western blotting respectively. Re

5、sults: Results detected by qRT扌以 PCR showedthat expressio n levels of HIST1H2AC and HIST1H2BC genes were sig ni fica ntlyunregulatedinPuta8988+andPuta8988+(P0.05). Results detected by Western blotting showed that expressio n levels of HIST1H2AC and HIST1H2BC were also sig ni fica ntlyunregulatedin t

6、hose cell lines withpemetrexed 拟 resista nce(P0.05).Con clusi on:Expressi ons ofHIST1H2AC and HIST1H2BC and their genes in pan creatic can cer cell line Puta8988 treated with pemetrexed are significantly up 拟 regulated, which implies that these genes possibly plays a role in pemetrexed拟 resista nee

7、of pan creatic can cer cell lines.Key words HIST1H2AC; HIST1H2BC; pancreaticcancer;Puta8988; pemetrexed; expressi on胰腺癌起病隐匿，手术切除率低，对传统放化疗不敏感，死亡发 病比达98% 5年生存率6%1-2，是威胁人类健康的“隐秘杀手”。 近年来的研究表明，辅助化疗有比传统化疗更好的疗效，已被认为是 与手术治疗同样重要的治疗方法。与此同时，多种针对胰腺癌的靶向药物也在不断被发现。然而，耐药现象的存在仍然是导致辅助化疗效 果欠佳或失败的主要原因。揭示胰腺癌化疗的耐药机制，建立更有

8、效 的化疗方法已成为国内外研究的重点3;而从分子生物学的层面来研究和寻找耐药基因，然后给予必要的干预，以提高辅助化疗疗效的 研究已成为当前最为关注的热点4。已有的研究表明，胰腺癌耐药 性与 MDR1(multidrug resista nce1) 、MRP(multidrug resista nee associated protein gene) 、LRP(lung resis 2 tance protein) 、 Bel拟,2(B拟cell lym 拟phoma/leuke拟.2)以及P53等基因有关，而这 些基因的一个共同特点是与其他癌症的耐药性也有关5。这就提示我们可以借鉴其他癌症发现

9、的耐药基因研究胰腺癌的耐药机制。有报道指出，组蛋白 HIST1H2AC(Histone 1,H2ac)和 HIST1H2BC(Histone 1,H2bc)基因与乳腺癌耐药性密切相关6。然而，它们是否在胰腺癌 耐药细胞株中表达至今很少有报道。本实验针对胰腺癌耐药细胞株中 HIST1H2AC和HIST1H2B(在基因和蛋白水平上的表达情况开展研究， 以探讨它们与胰腺癌耐药的关系及其可能的分子机制，为研发对抗和 逆转耐药的新方法提供新的靶点。1材料与方法1.1材料人胰腺癌细胞株：采用由东南大学中心实验室保存的人胰腺癌细胞株Puta8988。主要试剂：DME高糖培养基、胰蛋白酶为美国GIBCO公司产

10、品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，TRIZOL细胞裂解液为美国Invitrogen 公司产品，培美曲塞(pemetrexed)为法国礼来公司 产品，HIST1H2AC单克隆抗体和 HIST1H2BC多克隆抗体为美国 Ab nova 公司产品，二抗(羊抗小鼠IgG拟HRP为南京凯基生物公司，PDVF膜 为美国PALL公司产品，PCR引物由南京凯基生物公司合成。主要仪 器：北京泰克生物技术有限公司Realtime PCR Master Mix(S YBRGree n)，日本Nik on公司倒置相差显微镜，美国BECKMA公司高速冷 冻离心机，美国Bio拟.Rad公司电泳仪等。1.2方法1.2.1细

11、胞培养 胰腺癌细胞株Puta8988，以1/2 IC50浓度的 培美曲塞作耐药诱导，形成耐药细胞株Puta8988+。将培美曲塞浓度增加1倍再次作耐药诱导，形成耐药细胞株Puta8988+。Puta8988+、 Puta8988+培养在含10%台牛血清的 DMEM培养基中，37 C、5%CO2 条件下培养，隔天换液，细胞长满单层后用2.5 g L-1胰蛋白酶消化传代。1.2.2实时荧光逆转录聚合酶链反应(qRTUPCR)细胞总RNA提 取按照Trizol试剂盒说明进行。逆转录合成 cDNA的反应总体积为 20 l，RT的反应条件是：37 C温育30 min后，升温至65 C加热5 min，然后

12、4 C冷却5 min，瞬时离心。先在37 C保温1 h，然后 70 C保温15 min。反应产物行下一步扩增或-20 C保存。根据Gene Bank 中 HIST1H2AC HIST1H2BC勺 cDNA序列用 Primer 5.0 设计特异 性扩增引物，见表1。采用25卩I总反应体系：2X RTmix 12.5卩I;模板(cDNA稀释 10倍)1卩l;引物5 pmol l-1 mix 1 卩l;双蒸水10.5卩l扩增 条件：95 C 5 min，94 C 15 s、表1 PCR所用的引物序列及扩增 产物大小60 C 30 s，45个循环。一个样本做3个复孔，在96孔板 中上样定量检测。1.2

13、.3 Wester n blotti ng分别从培养好的细胞株提取细胞总蛋白进行定量，细胞总蛋白量为70卩g,将3组细胞的蛋白质常规PAGE 凝胶电泳并转移至PVDF膜，用5%兑脂奶粉封闭液中室温封闭1 h后 加入封闭液和一抗 HIST1H2AC抗体(1 : 500)，HIST1H2BC抗体(1 : 500)。在4 C下摇床摇荡孵育过夜。PBST漂洗滤膜4次，每次10 min。 将膜与HRP结合的二抗(辣根过氧化酶标记抗体，二抗用封闭液稀释 1 : 5 000)室温下摇荡孵育1 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次， 每次10 min。暗室中迅速将膜蛋白贴在 X线胶片上曝光，直至出现 最佳条带

14、。1.3统计学处理实验数据以士 s表示，采用Prism软件包分析，组间比较用t检验，P0.05为差异有统计学意义2结果2.1 qRT拟PCR检测HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在不同耐药处理胰腺癌细胞株中的表达水平以目标基因拷贝数与B拟.actin 拷贝数之比乘以100为HIST1H2A和HIST1H2B（基因在不同耐药处理胰腺癌细胞株 Puta8988 中的相对表达水平，实时荧光 PCR佥测结果（图1）表明，1/2 IC50浓 度培美曲塞诱导的耐药细胞株 Puta8988+,其HIST1H2A（基因的相对 表达水平调高，由其亲本Puta8988（对照）的0.340 士 0.070提

15、高到1.577 士 0.276，上升幅度达 4.64倍。如果培美曲塞的浓度加倍， Puta8988+中HIST1H2AC基因的相对表达水平进一步提高，达 2.000 士 0.185，是对照的 5.88倍，各处理间的差异均达到显著水平 （P0.05）。HIST1H2BC基因在上述耐药细胞株及其亲本中的表达水平 也有同样的趋势，但就其相对表达量而言，要比HIST1H2AC勺低，在Puta8988、Puta8988+、Puta8988+中分別为 0.027 士 0.003、0.153 士 0.023 和 0.623 士 0.048，在 Puta8988+、Puta8988+中 HIST1H2BC 的

16、mRNA相对表达水平分别比对照（Puta8988）调高5.67倍和23.07 倍，各处理间的差异也达到了显著水平（P0.05）。2.2 Western Blotting检测 HIST1H2AC和 HIST1H2BC蛋白在不同耐药处理胰腺癌细胞株中的表达水平Western Blotting检测结果（图2）表明，当胰腺癌细胞株Puta8988经过耐药诱导后，HIST1H2AC蛋白和HIST1H2BCS白的表达都上调，并随培美曲塞药物剂量的加大而上升。以目标蛋白灰度值与B拟act in蛋白灰度值之比为其相对表达水平，分析（图3）表明，耐药细胞株Puta8988+和Puta8988+中HIST1H2A

17、蛋白相对表达水平 要比其对照(Puta8988)分别提高54.35%和87.43%,处理间的差异显 著(P0.05)。而HIST1H2BC蛋白对耐药处理的响应更加明显，其在 Puta8988+和 Puta8988+中的相对表达水平比对照分别提高 189.26% 和774.85%,处理间的差异达极显著(P0.01)。3讨论有报道组蛋白HIST1H2AC HIST1H2BC与多种肿瘤的发生、发展 及临床结局有关7。近期的大量研究又发现，HIST1H2AC和 HIST1H2B(或其他组蛋白的基因在许多种肿瘤耐药细胞株中出现过度 表达。Mengual等8在膀胱癌耐药细胞的基因芯片中发现 HIST1H2

18、AC 基因表达上调2.5倍。P鮎rssinen等9在乳腺癌磷酸化细胞的基因 芯片中发现HIST1H2ACS因表达上调1.8倍。Silvia 等10在非小 细胞肺癌耐药细胞的基因芯片中发现HIST1H2BC基因表达上调3.2倍。本研究结果也显示，胰腺癌细胞株通过培美曲塞药物诱导后， HIST1H2AC HIST1H2BC基因和蛋白的表达水平都表现出上调，并随 诱导药物使用剂量的增加而提高。这就表明HIST1H2AC HIST1H2BC基因与胰腺癌的耐药性可能存在联系，这两个基因也可能是多个癌症 的耐药基因。从HIST1H2AC和HIST1H2BC勺基因表达情况来看，无论 是在对照细胞株 (Put

19、a8988)中，还是在耐药细胞株(Puta8988+、Puta8988+)中，HIST1H2AC基 因 的相对表达水平都要高于 HIST1H2BC图1)，但由于对照细胞株 HIST1H2BCS因的相对表达水 平仅是HIST1H2AC勺7.94%,如果与各自的对照相比较，耐药细胞株的HIST1H2BC基因调高幅度要明显高于HIST1H2AC这就提示HIST1H2BC基因表达对耐药性更加敏感。这种敏感性也能通过蛋白的 表达体现。图3显示，对照细胞株的HIST1H2BC!白相对表达水平仅 为HIST1H2AC勺0.63倍，而耐药细胞株 Puta8988+和Puta8988+的 HIST1H2BCI白

20、相对表达水平分别是 HIST1H2AC勺1.18倍和2.94倍。目前有关胰腺癌HIST1H2A（和HIST1H2B（基因耐药机制的研究成 果还未见报道，但可以预测，它们可能是胰腺癌耐药产生的重要基因。 组蛋白HIST1是染色质构成单元核小体的基本结构单位。HIST1H2AC和HIST1H2BC分别编码于组蛋白 H2A和H2B家族11，位于染色体 6p21.3和6p22.1，是构成组蛋白的基本核蛋白，主要负责染色体内 核小体的装配工作，被认为是和细胞复制及分裂有关的一组结构。本 研究采用的培美曲塞是2004年经美国食品与药品管理局批准应用于 临床的化疗新药，其作用靶点包括3个：第一靶点是嘧啶和嘌

21、呤合成 中的多种酶12，包括胸甘酸合酶，使dUMP专变成dTMP发生障碍， 从而抑制DNA合成;第二靶点是二氢叶酸还原酶，阻止二氢叶酸还原 成四氢叶酸，从而使一碳单位代谢形成障碍；第三靶点是甘氨酰胺核 苷酸转甲酰酶，使嘌呤核苷酸从头合成障碍。HIST1H2ACHIST1H2BC基因和蛋白表达水平在耐药细胞株中调高，可能与培美曲塞的第一靶点有关。胰腺癌细胞染色体遭培美曲塞损伤后， 通过调高HIST1H2AC HIST1H2BC基因和蛋白表达水平促进染色体的功能恢复，从而降低药 效。因此，进一步深入研究 HIST1H2AC和HIST1H2BC基因对培美曲塞 的耐药机理不仅具有重要的科学价值，而且具

22、有很重要的临床意义。【参考文献】1 JEMALA, MURRAY, WARDE, et al. Cancer statistics2005J. Cancer J Cli n,2005,55(1):10拟 30.2 PARKIN D M, BRAY F I, DEVESA S S. Can cer burden inthe year 2000:the global pictureJ.EurJCan cer,2001,37(8):4 拟.66.3 张翼，石欣.胰腺癌化疗进展J.世界华人消化杂志，2009, 17(14):1422 拟 1426.4 李静，赵玉沛只NA干扰技术及其在胰腺癌研究中的应用

23、J.肝胆胰外科杂志，2006, 18(2) : 127拟.129.5 孙诚谊，王百林，彭瑞云，等.胰腺癌与多药耐药基因LRP的相关性研究J.中华肝胆外科杂志，2004，10(4) : 281拟282.6 URQUIDV, GOODISOSIGe no mic sig natures of breastcan cermetastasisJ.Cytoge netGenomeRes,2007,118(2 拟4):116 拟129.7 COUZINJ. Cancer biology: a newcancer player takes the stageJ. Scie nce,2005,310(5749):766 拟 767.8 MENGUAL, BURSETM, ARS E, et al. Partially degraded RNA from bladder washi ng is a suitable sample