GnRHa对SD大鼠子宫内膜容受性的影响VIP

1、gnrha对sd大鼠子宫内膜容受性的影响目的:体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,ivf-et)中,优质的胚胎、接受态子宫内膜和胚胎与内膜发育的同步发育是胚胎成功种植的关键。冻融胚胎移植周期中,在胚胎质量一定的情况下,改善子宫内膜容受性,能改善胚胎种植结局。目前常用的子宫内膜准备方案主要有自然周期、诱导排卵周期及激素替代周期。近年来的研究提示,促性腺激素释放激素(gonadotrophinreleasinghormone,gnrh)不仅合成于中枢神经系统,通过下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-ovarya

2、xis,hpo)作用于卵巢及子宫,在卵巢、子宫等外周生殖系统也有合成,促性腺激素释放激素受体(gonadotrophinreleasinghormone,gnrhr)在卵巢颗粒细胞及子宫上皮和基质细胞表达也很丰富,其在子宫内膜的表达在黄体期升高,gnrh可能从多个层面调节生殖活动,改善子宫内膜容受性。子宫内膜腺体在胚胎种植过程中发挥着重要作用,白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,lif)是目前公认的子宫内膜容受性的标志物之一,胞饮突被认为是子宫内膜容受性经典的形态学标志,它们的出现与子宫内膜的“种植窗期”相吻合,子宫内膜腺体在胚胎种植过程中发挥着重要作用。本研究利

3、用雌(e)、孕激素(p)及促性腺激素释放激素激动剂(gnrha)建立sd大鼠(spparague-dawleyrats)子宫内膜准备方案模型。分析各方案中大鼠子宫内膜腺体数目、腺体总面积、lif表达水平及胞饮突的表达,研究gnrha对sd大鼠子宫内膜容受性的影响。方法:1sd大鼠一般状况评估自入组开始,密切观察大鼠活动情况,有无活动增多、躁动、进食量减少等低雌激素症状。每4天称量大鼠体重,分析大鼠体重变化,计算大鼠进食量。2不同方案内膜准备方法sd大鼠模型的建立实验动物为雌性未孕sd大鼠,每日上午9:00行阴道细胞涂片检查确定大鼠生殖周期,超声检测大鼠子宫内膜厚度,连续观察2周期。选60只有正

4、常生殖周期的大鼠,随机分为四组,自然周期组(naturecyclegroup,ncgroup)、人工周期组(hormonereplacementtherapygroup,hrtgroup)、高剂量gnrha降调节联合人工周期组(high-dosegnrhaandhormonereplacementtherapygroup,hdg-hrtgroup)、低剂量gnrha降调节联合人工周期组(low-dosegnrhaandhormonereplacementtherapygroup,ldg-hrtgroup),每组15只,各组大鼠周龄及体重无差别。自然周期组大鼠肌肉注射无菌注射用水0.2ml,28

5、天后查阴道细胞涂片,动情期与雄鼠合笼,次晨检出现阴道栓或者记为孕0天;人工周期组大鼠肌肉注射无菌注射用水0.2ml,28天后每日给予补佳乐0.42mg/kg灌胃,超声监测大鼠子宫内膜厚度,达到自然周期中动情期大鼠子宫内膜厚度的平均值2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时与成年雄鼠合笼,次晨检测到阴道栓者记为孕0天,同时加用黄体酮6mg/kg肌注;高剂量降调节联合人工周期组、低剂量降调节联合人工周期组于动情间期给予达菲林0.4mg/kg、0.2mg/kg肌肉注射,给药28天开始给予补佳乐0.42mg/kg灌胃,超声监测子宫内膜厚度,根据内膜厚度及阴道细胞学涂片情况

6、调节补佳乐用药时间,内膜厚度达到自然周期中动情期大鼠子宫内膜厚度的平均值2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时加用黄体酮6mg/kg肌注,并与雄鼠交配,晨起检出阴道栓者记孕0天,各组大鼠均于孕4天处死大鼠并取子宫。3不同内膜准备方案sd大鼠子宫内膜厚度的超声测量运用philipsiu22多普勒超声仪检测大鼠子宫内膜厚度,使用30mhz高频电子线阵探头进行检测,测量双侧子宫内膜最厚的位置的厚度,并取平均值。超声检查大鼠子宫内膜厚度的时机为:分组前确定大鼠生殖周期时同时测量生殖各周期大鼠子宫内膜厚度;nc组大鼠检测动情间期、动情期子宫内膜厚度;hrt组自动情间期开始

7、给补佳乐时监测子宫内膜厚度,直至达到自然周期动情期水平2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时给予黄体酮,hdg-hrt组、ldg-hrt组降调节0、7、14、21、28天测量大鼠子宫内膜厚度,给补佳乐后每日监测子宫内膜厚度,直至达到自然周期动情期水平2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时给予黄体酮转化内膜。4sd大鼠子宫内膜容受性指标的分析方法首先,取各内膜准备方案组中sd大鼠子宫,进行he染色,从低倍至高倍镜观察各组大鼠子宫内膜在光镜下的组织学形态,计数各组大鼠子宫横断面中腺体的数目。hmias-2000高清晰度彩色医学图文分析

8、系统(武汉千屏影像技术有限责任公司)分析各个标本横断面腺体的总面积。其次,用免疫组化sp法定位大鼠子宫内膜lif定位并进行半定量分析,每份标本随机选取5个视野,记录腔上皮及腺上皮细胞染色强度及各强度细胞数所占百分比,并用免疫组织化学评分法h-score法对lif表达量进行半定量分析,计算公式为?ipi(10)1(,pi为阳性细胞百分率,i为染色强度,以每张切片染色底背景作为对照,不显色或显色不清为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;深褐色为3分。第三,用s-3500n扫描电镜观察大鼠子宫胞饮突表达情况并用胞饮突评分法分析大鼠子宫内膜胞饮突表达量的差异,具体为:扫描电镜下,放大3500倍,视野下可

9、观察到的子宫内膜上皮细胞数量为250个,每个标本随机选取50个视野,50个视野内胞饮突的表达数量作为胞饮突评分,计算各组大鼠胞饮突评分均值;5统计学方法:采用spss17.0统计软件进行数据统计,计量资料以均数标准差表示,方差齐性检验,三组以上采用方差分析,组间差异采用lsd法,两组数据比较采用t检验,以0.05为检验水准,当p<0.05时,差异有统计学意义;当p>0.05时,差异无统计学意义。结果:1各组sd大鼠一般状况评估降调节第5天开始,hdg-hrt及ldg-hrt组大鼠出现躁动,进食量减少等低雌激素症状,毛色晦暗;降调第14天,hdg-hrt及ldg-hrt组与自然周期组

10、相比,进食量减少,但无显著区别(p=0.100,p=0.120),体重略下降,无统计学差异(p=0.140,p=0.130)。给予雌激素后,降调节组大鼠进食量增加,体重逐渐上升,低雌激素症状消失。处死前,各组大鼠体重无明显差异(p=0.100),进食量差异无统计学意义(p=0.100)。2sd大鼠阴道细胞涂片结果自然周期中大鼠阴道细胞涂片呈周期性变化,约4天一周期,依次为动情前期,动情期,动情后期,动情间期。动情前期,持续约9-18小时,阴道涂片上全部为有核上皮,偶见少量角化细胞;动情期,持续约1天,阴道涂片显示全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞;动情后期,持续约10-14小时,此期阴道涂片

11、显示为白细胞、角化细胞及有核上皮均有;动情间期,持续约2-2.5天,此期阴道涂片显示为大量白细胞及少量上皮细胞和黏液。hrt组大鼠雌激素给药后,阴道涂片细胞逐渐变化,无核上皮逐渐增多,直至全部为无核上皮。hdg-hrt组、ldg-hrt组大鼠降调节5天后阴道涂片细胞去周期变化,表现为大量白细胞及少量上皮细胞和黏液,给予雌激素灌胃给药后逐渐转变有核上皮至全部变为无核上皮。综上所述,给予雌激素后,hrt组、hdg-hrt组、ldg-hrt组大鼠阴道细胞涂片逐渐变化,角化上皮逐渐增多直至全部变为角化上皮,与动情期阴道细胞学涂片表现一致。3超声下sd大鼠子宫内膜厚度3.1自然周期sd大鼠生殖周期各期子

12、宫内膜厚度自然周期中大鼠动情周期次序为:动情前期、动情期、动情后期、动情间期,内膜厚度随动情周期呈周期性变化,分别为2.760.08mm,2.820.10mm,2.780.09mm,2.700.07mm。动情期子宫内膜比动情前期、动情后期、动情间期厚(p=0.000,p=0.009,p=0.000)。动情间期子宫内膜最薄,与动情前期相比,无统计学差异(p=0.100);动情后期子宫内膜厚度大于动情间期(p=0.000)。动情前期与动情后期相比,无显著差异(p=0.160)。3.2各内膜准备方案中大鼠子宫内膜厚度3.2.1降调节组sd大鼠子宫内膜变化降调节第1至28天,hdg-hrt组、ldg-

13、hrt组大鼠子宫内膜逐渐变薄,给药第7天,两组大鼠内膜厚度与对照组相比,hdg-hrt组内膜厚度低于ldg-hrt组,差异有统计学意义(1.280.05mm,1.530.1mm,p=0.000)。降调节第14天、21天、28天,两组内膜厚度相比,差异无统计学意义(p=0.120,p=0.051,p=0.105)。3.2.2各组sd大鼠用药情况nc组大鼠没有使用外源性激素,hrt组大鼠没有使用降调节药物。以内膜厚度达到大鼠自然周期动情期子宫内膜平均厚度2.82mm、阴道细胞涂片表现为全部为无核角化上皮或间有少量上皮细胞时为观察日,各组大鼠雌激素用药时间进行比较,hrt组、hdg-hrt组和ldg

14、-hrt组雌激素用药天数分别为4天,10.9天,9.9天,hrt组短于hdg-hrt组和ldg-hrt组,差异有统计学意义(p=0.000,p=0.000),hdg-hrt组比ldg-hrt组用药时间长,但无明显差别(p=0.068);hrt组、hdg-hrt组和ldg-hrt组雌激素累计用药量分别为1.68mg,4.59mg,4.14mg,hrt组显著低于hdg-hrt组和ldg-hrt组(p=0.000,p=0.000),hdg-hrt组明显高于ldg-hrt组(p=0.048)。hrt组、hdg-hrt组和ldg-hrt组黄体酮使用天数及剂量相同。3.2.3内膜转化期各组sd大鼠子宫内膜

15、厚度nc组大鼠动情期子宫内膜厚度为2.810.16mm,hrt组、hdg-hrt组和ldg-hrt组加用黄体酮日各组子宫内膜厚度依次为2.830.2mm,2.830.3mm,2.830.4mm,各组子宫内膜厚度比较无统计学差异(p=0.110)。4sd大鼠子宫内膜容受性指标结果4.1光镜下各组sd大鼠子宫内膜组织形态比较nc组大鼠腺体数目为9.71.6,腺体面积为1870.07162.93m2,hrt组、hdg-hrt组和ldg-hrt组腺体数目分别为9.81.5,11.11.7,10.81.4,腺体面积为1834.87154.07m2,2078.76161.16m2,2010.88178.9

16、9m2。hrt组与nc组腺体数目及面积均无显著差异(p=0.814,p=0.560);hdg-hrt组和ldg-hrt组与nc组相比,腺体数目(p=0.016,p=0.049)及腺体面积(p=0.001,p=0.000)均明显增大;hdg-hrt组和ldg-hrt组与hrt组相比,腺体数目增多(p=0.028,p=0.041),腺体面积增大(p=0.000,p=0.000);hdg-hrt组与ldg-hrt组之间相比,腺体数目及腺体面积均无统计学差异(p=0.638,p=0.600)综合以上数据及光镜下观察子宫内膜形态,hdg-hrt组、ldg-hrt组与nc组及hrt组相比,腺体数目更多,形

17、态不规则,腺体分泌空泡明显,腺腔分泌物更多,间质疏松水肿更加明显。4.2sd大鼠子宫内膜lif表达情况nc组大鼠种植窗期lif组织学评分为2.590.38,hrt组、hdg-hrt组和ldg-hrt组大鼠子宫内膜lif组织学评分分别为2.580.24,2.700.42,2.720.65,hrt组lif表达量略低于nc组,但两组表达量无统计学差异(p=0.657)。hdg-hrt组lif表达量较ldg-hrt组高,但差异无统计学意义(p=0.460)。hdg-hrt组、ldg-hrt组lif表达量显著高于nc组(p=0.000,p=0.000)。hdg-hrt组、ldg-hrt组lif表达量显著

18、高于hrt组(p=0.000,p=0.000)4.3sd大鼠子宫内膜胞饮突形态nc组为发育完全的胞饮突,表达明显,发育同步,大小一致,表面光滑,其余内膜表面被短小的微绒毛覆盖。hrt组胞饮突为发育中的胞饮突,发育不同步,大小不一致,表面不甚光滑,余内膜面可见浓密的微绒毛覆盖。hdg-hrt组为发育完全的胞饮突,表达明显,大小一致,发育同步,形态饱满,表面光滑,微绒毛短小。ldg-hrt组胞饮突表达明显,发育同步,大小一致,为发育完全的胞饮突,形态饱满,表面较为光滑,余内膜面微绒毛短小。综上所述,hrt组与nc组相比,胞饮突大小不一致,表面不够光滑;经gnrha预处理的hdg-hrt组、ldg-hrt组与nc组相比,胞饮突发育完善,形态更加饱满,微绒毛短小。4.4sd大鼠子宫内膜胞饮突评分nc组胞饮突评分为674.827.2。hrt组、hdg-hrt组和ldg-hrt组胞饮突评分分别为666.927.5,708.430.3,716.731.4。各组间相比,hrt组与nc之间相比,胞饮突评分无统计学差异(p=0.459);hdg-hrt组、ldg-hrt组胞饮突评分显著高于nc组(p=0.003,p=0.000);hdg-hrt组