1034.环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制作用研究

1、环磷酰胺对hela细胞增殖的抑制作用研究 摘要 研究环磷酰胺对hela细胞增殖的抑制作用。采用mtt法测定50、100、200、400g/ml的环磷酰胺对hela细胞增殖的影响，结果表明环磷酰胺对hela细胞增殖具有抑制作用，且随着环磷酰胺浓度的增加，细胞增殖抑制率也是逐渐增大的。关键词 环磷酰胺；mtt法；hela细胞前言宫颈癌是威胁女性生命健康的妇科肿瘤之一，在全世界范围内发病率和死亡率居妇科恶性肿瘤的第1位，严重威胁着全球妇女的生命安全1。目前晚期宫颈癌多采用保守治疗，环磷酰胺是其化疗较为有效的药物，本研究借助体外培养技术，以不同浓度的环磷酰胺刺激人宫颈癌hela细胞，测定其细胞增殖抑制

2、率，为进一步探讨环磷酰胺的作用机制，指导宫颈癌临床用药提供理论依据实验。1 材料hela 细胞系(人宫颈癌细胞)2 实验方法2.1 普通mtt法实验步骤2.1.1 稀释细胞：用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞，用含5%10胎牛血清的培养液将细胞吹打为单细胞悬液，调整细胞浓度约为5105个/ml；取100l加入900l的培养液内，得到浓度约为5104个/ml作为原初浓度的细胞。对原初浓度的细胞进行1：1倍比稀释，分别得到1：2、1：4和1：8的稀释细胞 （细胞浓度约为2.5104个/ml、1.25104个/ml和0.625104个/ml）。2.1.2 接种细胞：取上述的各浓度的细胞各200l

3、，接种到96孔板内；一般同一浓度的细胞接种4孔作为重复实验。同时，将未知浓度的细胞200l作为待测样品同样加到96孔板的4个孔内。2.1.3 培养细胞：同一般培养条件，培养35天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。2.1.4 呈色：培养35天后，每孔加5 mg/ml的mtt溶液20l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加dmso 150l，振荡30min，使结晶物充分融解。2.1.5 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。2.1.6 分析与计算：通过excel软件以吸光值为横坐标，接种细胞浓度为纵坐标绘制曲线；生成接种细胞

4、浓度与吸光值间的趋势曲线及其指数方程，根据该方程计算出未知浓度的原始接种浓度。2.2 药物mtt法实验步骤2.2.1 接种：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23104/ml，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。2.2.2 培养与药物处理：培养箱内培养2436h，吸出培养液加入不同浓度梯度的环磷酰胺各200l，原则上，每个浓度至少接种4孔作为重复实验，否则难以反应真实情况。2.2.3 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的mtt溶液20l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；

5、然后每孔加dmso 150l，振荡30min，使结晶物充分融解。2.2.4 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。2.2.5 计算与分析：按照公式计算各种药物处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率（未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。若该值为正说明药物对细胞增殖具有抑制作用，若值为零表明药物对细胞增殖无影响；若值为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。2.2.6 对照设置：本实验设置调零孔（培养基、mtt、二甲基亚砜），且必须设置对照孔（细胞、培养液、mtt、二甲基亚砜）。3 实验结果与分析表1 不同浓度环磷酰胺对hela细

6、胞增殖的抑制作用药物名称对照药物1药物2药物3药物4环磷酰胺0.869 50g/ml100g/ml200g/ml400g/ml0.549 0.481 0.430 0.331 36.82%44.65%50.52%61.91%配制50、100、200、400g/ml环磷酰胺作用于细胞，用mtt法测定不同浓度环磷酰胺对hela细胞增殖的抑制效果。结果见上表。由上表可以看出，50、100、200、400g/ml环磷酰胺作用于细胞，细胞增殖抑制率分别为36.82%、44.65%、50.52%、61.91%。由于细胞增殖抑制率为正值，说明环磷酰胺对hela细胞增殖具有抑制作用。与对照组相比实验组细胞生长抑

7、制率明显高于对照组，抑制率随着环磷酰胺作用浓度的增加而增加，呈药物浓度依赖性。4 讨论由于晚期宫颈癌多采用保守治疗，其化学治疗越来越被国内外重视。既往普遍认为化疗药物杀灭肿瘤细胞的机制是其对基因组的毒性导致dna异常，不能维持复制功能。现已明确，无论药物的作用靶点何在，各种化疗药物最终通过诱导凋亡或肿瘤坏死而达到治疗目的2 。环磷酰胺是临床上治疗宫颈癌的常用抗癌药物之一。本研究根据文献资料药物的常用浓度，用mtt比色法检测环磷酰胺对hela细胞增殖抑制作用，结果表明顺铂在50-400g/ml范围内对hela细胞都有抑制作用，且随着环磷酰胺浓度的逐渐增加，hela细胞的增殖程度下降。此结果表明环

8、磷酰胺可显著抑制子宫颈癌细胞hela细胞的生长，且其作用具有一定的量效关系。很多研究表明，许多其它的抗癌药物抑制体外培养的hela细胞生长，除了呈量效关系之外，还呈时效关系。李富仁3研究了澳洲茄胺盐酸盐( s o l a s o d i n e h y d m e m o r i d e，s b h l)对hela细胞的生长增殖有抑制作用，且随给药的浓度与时间的增加抑制作用增强，呈量效、时效关系。庞荣清4研究了阿霉素、紫杉醇和顺铂都能有效抑制细胞生长，以剂量依赖方式和时间依赖方式降低端粒酶活性，这种降低与活性细胞减少密切相关。饶毅5证明了随着时间的延长，药物作用效果更加明显。因此，本人认为环磷

9、酰胺抑制子宫颈癌细胞hela细胞的生长的作用也具有一定的时效关系。不过确切机制尚待进一步研究。环磷酰胺是进入体内被肝脏或肿瘤内存在的过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，变为活化作用型的磷酰受氮芥而起作用的氮芥类衍生物。抗瘤谱广，是第一个所谓潜伏化广谱抗肿瘤药，对白血病和实体瘤都有效。环磷酰胺在体外无活性，它主要通过肝的酶p450水解成醛酰胺再运转到组织中形成磷酰胺氮芥而发挥作用。环磷酰胺可由脱氢酶转变为羧磷酰受而失活，或以丙烯醛形式排出，导致泌尿道毒性。属于周期非特异性药，作用机制与氮芥相同。对环磷酰胺的耐药实验动物模型中主要表现为：醛脱氢酶的活性增高；通过谷胱甘肽转移酶与谷胱甘肽结合；dna的修复增

10、加，在临床上耐药的机制正在研究，很多学者认为与多药耐药基因和p糖蛋白相关。本研究从细胞增殖的角度出发进行研究，实验表明环磷酰胺可以抑制肿瘤细胞增殖，因此认为环磷酰胺可以通过抑制其增殖而达到化疗作用，为临床用药提供了可靠的依据。参考文献1 石左萍,田秀珠.顺铂诱导宫颈癌hela细胞凋亡及对fhit,ki67和bax表达的影晌.山西医科大学学报,2008,39(10):898-900.2 bose r，verheij m，haimojtzfriedman a，et a1ceramide synthase mediates daunorubicin-induce apoptosis：an alternative mechanism for generating death signalsjcell，1995，82(3):405414.3 李富仁,刘良.澳洲茄胺盐酸盐对体外hela细胞培养生长抑制作用的研究.现代