基因工程毕设答辩PPT模板

1、对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因的克隆及纯化,07100 食品专业 指导老师： 2011.5.08,一、研究背景 二、研究意义与目的 三、实验设备 四、毕业设计概述与成果展示 五、问答时间 六、致谢,研究背景,世界对虾养殖业兴起于20世纪70年代，并在80年代得到飞速发展 我国沿海地区经济的重要产业之一就是中国对虾(penaeus chinensis) 的养殖, 并且养殖产量在 1993 年以前连续几年位居世界前列 对虾养殖业发展快速，伴随养殖环境恶化、种质退化和种质资源破坏、非传染性疾病以及传染性疾病等一系列问题逐步滋增，严重制约着对虾养殖业的进一步发展。 next,研究背景,对虾病毒

2、病，已成为阻碍对虾养殖业发展的主要因素 白斑综合症病毒white spots syndrome virus 简称 wssv，是1993年来引发我国大面积暴发对虾病毒性疾病的主要病因 ； 中美学者徐洵等和荷兰学者van hulten 等先后完成了 wssv 的基因组全序列的测定 ； 近年来研究的热点问题就是对虾免疫学，目前对虾的免疫研究主要集中在抗菌方面，而有关抗病毒作用的研究较少，而病害控制除了病原以外，宿主本身的抗病能力也是一个重要因素。 back,研究意义与目的,有研究以证明囊膜蛋白vp28与对虾白斑综合征系统感染有关。对探索wssv病毒膜蛋白在感染过程中的作用，应该从病毒和宿主两方面入手

3、，为建立有效的防治方法提供科学依据。 本实验着重研究与对虾wssv病毒的感染密切相关的主要囊膜蛋白vp28，对此基因进行克隆与表达，为探讨wssv病毒感染的分子机制提供良好的基础材料。 back,毕业设计概述与成果展示,毕业设计分三大部分： 基因重组 基因表达 蛋白质纯化,back,基因重组,pcr扩增vp28基因(图3-1) 将含有pgex-4t-2的大肠杆菌接种 琼脂粉凝胶电泳 到5l lb培养液中，37中摇培过夜 割取目的条带 按试剂盒提取质粒，最后溶于30lddh2o中 胶回收，溶于30lddh2o中 取3l电泳，确定质粒浓度 取3l电泳，确定目的基因浓度 取适量质粒双酶切（同酶） 取

4、适量目的基因质粒双酶切 酶切后的质粒电泳 酶切产物琼脂电泳 割取目的条带 割取目的条带 胶回收，最后溶于25 lddh2o 胶回收，溶于25 lddh2o中 取3 l电泳，确定经酶切质粒浓度 取3l电泳，确定经酶切目的基因浓度 根据经酶切基因浓度：经酶切质粒浓度=（510）：1比例连接（16 过夜） 转化涂布于平板，37 过夜，次日(图3-2)筛选阳性菌落，进行菌落pcr,back,基因表达,菌落pcr 筛选阳性菌株，阴性菌株排除 挑取23个阳性菌株，37摇床过夜培养 取1.5ml菌液提取质粒，溶于30lddh2o中 取15l做双酶切鉴定，如图可确认为阳性菌 取1.5ml阳性菌液送去测序 另外

5、取5l菌液接种到5ml培养基中， 37摇培过夜 取200l菌液接种到5ml培养基中，37 摇培到od 1.0 先吸取1ml菌液到ep管中，剩下的加入iptg至终浓度0.25mm续培46h 收集菌体，加入1pbs 300l超声破碎，10,000rpm离心5min，取上清100l，加入蛋白loading buffer 40l(已配10:1)；沉淀用100l 1pbs溶解同样加入已配蛋白loading buffer 40l，热水煮5min, 10,000rpm离心5min,取上清10l电泳,back,蛋白质纯化,诱导条件的确定 蛋白质纯化（见图3-7） 根据上图实验结论，应该从上清中纯化蛋白,bac

6、k,实验设备,pcr仪； 电泳仪； 脱色摇床； 净化工作台； 生化培养箱； 暗箱紫外分析仪； 恒温摇床培养箱； 超声波细胞粉碎机； 电脑型烧烤微波炉； 各种量程微枪注射器； 贝克曼茨地式冷冻离心机； eppendorf centrifuge 5415d离心机等。,back,实验成果vp28基因的克隆,（一）vp28基因的pcr扩增结果 vp28基因的pcr产物经电泳后，在约650bp处可清楚地观察到dna条带，大小和vp28基因一致，结果见图3-1。 m 1 2 3 4 5,图3-1 vp28基因的pcr产物电泳图 m：dna mark； 1：对照组vp28基因的pcr产物； 25：实验组vp

7、28基因的pcr产物,back,实验成果重组质粒菌落培养结果,（二）重组质粒菌落培养结果 vp28基因的pcr产物与质粒4t-2载体均经noti和smai双酶切后，连接、转化至重组大肠杆菌中， 进行培养。所培养菌落见图3-2。,图3-2 重组质粒重组大肠杆菌菌落培养图,back,实验成果重组大肠杆菌菌落的pcr扩增结果,（三）重组大肠杆菌菌落的pcr扩增结果 重组质粒所培养的重组大肠杆菌pcr扩增电泳的结果见图3-3。如图，在630bp左右处可在28孔中清晰 看到所培养菌落的dna条带，1孔为阴性对照，无目的基因条带，说明所挑选的重组大肠杆菌菌落都为阳性 菌落，根据引物二聚体的条带亮度选择2、

8、4、6三个阳性菌落接种过夜培养。 m 1 2 3 4 5 6 7 8,图3-3 菌落pcr产物电泳图 m：dna mark； 1：阴性对照组； 28：重组大肠杆菌的pcr产物,back,实验成果重组质粒酶切鉴定结果,（四）重组质粒酶切鉴定结果 从pgex-4t-2转化平板上挑取若干克隆所得质粒后，经noti和smai联合酶切联，酶切产物 电泳图见图3-4。 m 1 2 3 4 5 6 7,图3-4 重组质粒酶切电泳图 m：dna mark； 1、3、5：未酶切菌种pgex-4t-2质粒； 2、4、6：重组表达载体4t-2质粒双酶切； 7：目的基因回收条带,back,实验成果诱导条件的确定,在1

9、8下，以iptg终浓度为0.25 mmoll的诱导条件诱导表达蛋白的电泳胶结果观察，选择 确定最佳的诱导条件。,m 1 2 3 4 5 6,图3-5 18，24h 诱导结果电泳图 m：蛋白质marker; 1：未诱导4t-2菌；2：已诱导4t-2菌；3：未诱导重组菌；4：已诱导重组菌； 5：18 5ul 250mm/mliptg 24h诱导上清； 6：18 5ul 250mm/mliptg 24h诱导沉淀,back,90.1kda 66.2kda 43.0kda,实验成果诱导条件的确定,图3-6 37，2h和4h 诱导结果电泳图 m：蛋白质marker； 1：未诱导4t-2菌；2：已诱导4t-

10、2菌； 3：未诱导重组菌； 4：已诱导重组菌； 5：37 5ul 250mm/ml iptg 2h诱导上清； 6：37 5ul 250mm/ml iptg 2h诱导沉淀； 7：37 5ul 250mm/ml iptg 4h诱导上清； 8：37 5ul 250mm/ml iptg 4h诱导沉淀,m 1 2 3 4 5 6 7 8,back,90.1kda 66.2kda 43.0kda,实验成果诱导条件的确定,（六）纯化蛋白质的电泳鉴定 按步骤（十一，3、）将表达产物裂解上清液，超声波表达产物上清，沉淀，电泳，经过染色， 脱色， vp28在55kda处有一明显的表达带，如下图3-6所示，与预期的目的蛋白带大小一致，重组 质粒中vp28基因获得表达。 m 1 2 3 4 5 6 7 8,图3-7 18，24h诱导结果与纯化的vp28蛋白电泳图 m：蛋白质marker; 1：未诱导4t-2菌；2：已诱导4t-2菌； 3：未诱导重组菌； 4：已诱导重组菌； 5：18 5ul 250mm/mliptg 24h诱导上清； 6：18 5ul 250mm/mlipt