甘草中甘草酸的提取纯化以及多糖的提取

1、生 化 实 验 报 告 设计性实验甘草中甘草酸的提取纯化以及多糖的提取一.实验目的（一）掌握甘草酸的提取原理和方法。（二）熟悉皂甙的性质和测定方法。（三） 掌握甘草酸的分离纯化方法。（四） 掌握多糖类物质的提取方法。二.实验原理（一）甘草酸提取原理中药甘草，属豆科植物，生长于草原向阳干燥钙质土地以及河岸沙质地土壤中，富含甘草皂苷，又称甘草酸，特点是高甜度、低热能、安全无毒，起泡性和溶血作用很低。具有增溶、增加药物稳定性、提高生物利用度及降低毒副作用的功效。甘草酸的许多金属盐，人体可适当吸收，不易造成元素的积蓄中毒。因此常被用来配制成健脾开胃、止咳化痰、顺气止喘、治疗慢性肝炎、降低血脂的良药。同

2、时还具有抗癌防癌、干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂等功能。甘草酸在原料中以钾盐或钙盐形式存在，其盐易溶于水，因此可用极性溶剂提取，提取后滤液再加硫酸，因难溶于酸性溶液而析出游离甘草酸。（二）甘草酸的纯化原理提取的甘草酸溶液中，还含有大量的蛋白质、果胶、鞣质等物质，在提取过程中，这些杂质也转移到了提取液中。由于这些物质的大量存在，使得产物的含量降低，试验误差加大，同时甘草酸作为药物和保健品等使用时，杂质还会引起一些副作用，因此必须将这些杂质除去，对甘草酸进行纯化。提取后滤液再加硫酸，因难溶于酸性溶液而析出游离甘草酸。（三）残渣中甘草多糖的提取分离原理甘草在中医处方中占有举足轻重的地位，被医药界誉为“

3、众药之王”。甘草的主要有效成分是甘草酸、黄酮和多糖类化合物，但目前多糖还没有被有效利用。甘草多糖具有抗肿瘤、免疫调节作用、抗辐射、抗病毒、抗溃疡、降血糖、抗衰老和免疫调节等作用，因此对多糖的研究越来越受到人们的重视。本实验以提取甘草酸后的甘草渣为原料提取多糖，这对甘草资源的综合利用和多糖的开发均具有特别重要的意义。甘草多糖为易溶于水的白色粉末，熔点很高，不溶于酒精等有机溶剂，故可用水提醇沉法得到甘草多糖。三.实验器材（一）仪器、用具:剪枝剪、粉碎机、烘箱、微波炉、电子天平、抽滤机、分光光度计、真空干燥箱、xad9 型树脂、旋转蒸发仪、柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器）（二）试

4、剂：甘草、极性溶剂、硫酸、苯酚、95%乙醇、葡萄糖标准品、70%乙醇、甘草酸标准品。四.实验内容及步骤（一）甘草酸的提取、测定1.将预先晾干的甘草用剪枝剪剪成小块，将小块放入烘箱中进一步烘干一昼夜。2.将已烘干的甘草小块用粉碎机将其粉碎成粉末。3.将甘草粉末用筛子筛去大的颗粒。4.称10g 甘草粉末, 加蒸馏水100ml, 在微波炉内加热4min, 在微波炉内加热过程中避免爆沸，防止提取液流失。把已经提取完的提取液用一层滤纸减压过滤，留取残渣和提取液备用。量取提取液的体积。5.甘草酸的测定：用甘草酸标准品绘制标准曲线精密称取甘草酸标准品10.00mg，置于10ml容量瓶中，加70%乙醇溶解定容

5、。精密吸取0.50ml，0.75ml， 1.00ml，1.25ml，1.50ml，分别置于25ml容量瓶中，加70%乙醇摇匀，定容，静置20min，在波长254nm处测定吸光值。以浓度x(mg/ml)为横坐标，吸光度y为纵坐标绘制标准曲线，计算出回归方程。提取液摇匀，准确移取5ml的提取液转移到25ml容量瓶中，用70%乙醇定容，静置20min后，于254nm处测定吸光度。测定吸光度值，由回归方程求出待测样品总甘草酸浓度，进而得出甘草酸的提取率。a=13.17c0.017 （参考）式中：a-吸光度； c-浓度，mg/ml甘草酸提取率= ncv/m100%其中：n-提取液稀释倍数 c-提取液中甘

6、草酸的浓度mg/ml v-提取液体积，ml m-甘草的质量，mg6. 实验数据及处理（1）标准曲线编号012345吸光度00.27310.38990.49360.58650.7336浓度mg/ml00.020.030.040.050.06甘草酸标准曲线y = 11.866x + 0.0172r2 = 0.995400.10.20.30.40.50.60.70.800.010.020.030.040.050.060.07甘草酸浓度mg/ml吸光度系列1线性 (系列1)（2）样品的提取率项目结果吸光度0.0221浓度0.000413稀释倍数5提取液体积/ml100甘草质量/g10提取率0.0206

7、47（二）甘草酸的纯化1. 甘草酸滤液预处理：甘草酸溶液减压浓缩至大约30ml，滴加3.5mol/l的硫酸至ph23，静置使之完全沉淀，离心，沉淀用去离子水洗23次，放入真空干燥箱中干燥，得甘草酸粗品。2. 大孔树脂吸附法纯化甘草酸把甘草酸粗品加热使之溶于500ml 的水中, 使甘草酸溶液与xad9 型树脂( 150g 活化树脂) 混合, 静态吸附2h, 用四层纱布过滤, 抽滤, 滤液进行减压蒸发浓缩至50ml, 加6%的盐酸10ml, 观察有无白色沉淀产生。滤渣( 树脂) 用300ml 50% 乙醇溶液搅拌洗脱2h, 洗脱液进行减压蒸发浓缩至干, 称重,计算纯化的得率。3.实验数据及处理项目

8、结果甘草质量/g10纯化后质量/g0.08纯化得率0.008（三）残渣中甘草多糖的提取分离1.甘草多糖的提取先将甘草残渣干燥，然后称重。再将提取完甘草酸的残渣置500 ml 烧杯中，加水50 ml，35 水浴中超声提取30 min，过滤，滤渣再加水50 ml，重复超声提取1次后，合并2 次提取液。 2.甘草多糖的测定：（1）用葡萄糖绘制标准曲线精密称取105干燥恒重的葡萄糖标准品100mg,置于100 ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 ml分别置于50 ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取上述各种溶液2.0 ml,分别加

9、入5%苯酚溶液1.0 ml,摇匀,迅速加入5.0 ml浓硫酸,振摇5min,置沸水浴上加热15 min,然后置冷水浴中冷却30 min,随行空白,在490 nm波长处测定吸光度。以标准溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。（2）提取液中多糖含量测定取提取液摇匀，准确移取5ml的提取液转移到25ml容量瓶中，取溶液2.0 ml,分别加入5%苯酚溶液1.0 ml,摇匀,迅速加入5.0 ml浓硫酸,振摇5min,置沸水浴上加热15 min,然后置冷水浴中冷却30 min,在490 nm波长处测定吸光度，由回归方程求出待测样品总甘草多糖浓度，进而得出甘草多糖的提取率。3.取得甘草多糖固体将合并的提取液在旋转蒸发仪上减压浓缩至50 ml，室温冷却后将浓缩液离心( 5 000 rmin 1，5min) ，弃去杂质沉淀。缓慢地加入4 倍量95% 乙醇，并不断用玻璃棒搅拌，使甘草多糖充分析出，静置24 h 后，离心( 5 000 r，5 min) 得甘草多糖沉淀，再用无水乙醇洗涤2 3 次后，60 下干燥，得甘草多糖。 五.实验数据及处理1、甘草多糖标准曲线编号01234567吸光度00.06270.15140.21020.31540.42930.53420.6015取液体积00.40.81.21.622.42.8浓度00.0080.0160.0240.0320