电转法将DNA导入哺乳动物细胞核中

1、电转法将dna导入哺乳动物细胞核中一、实验目的 掌握nucleofection(tm)电转法转染细胞的基本原理和技术要点。二、实验原理nucleofection(tm)电转染技术是德国amaxa公司的专利技术，在特定的细胞核转染溶液中，通过应用电穿孔技术将外源核酸直接导入真核细胞的细胞核内的转染方法。该技术十分有利于促进外源dna或sirna等高效率转染靶细胞，可在数小时内完成整个转染和分析的过程，从而促进通过过表达或干涉手段分析基因功能的研究。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, gfp）由283个氨基酸残基组成，最早从华盛顿星期五港水域的维多利亚水母体内克隆得

2、到。后来发现其他品种的水母也存在类似的荧光蛋白。gfp的荧光团是ser-65，tyr-66和gly-67形成的环状结构。gfp通过自催化氧化反应产生荧光团，这一催化反应在gfp翻译后约4小时进行，人工诱变的gfp可以缩短这一时间间隔。由于荧光蛋白在医学、生物学领域的广泛应用，该技术被授予2008年度诺贝尔奖。其中利用gfp真核表达质粒转染哺乳动物细胞，可在荧光显微镜下直观地检测转染效率。三、实验仪器、材料和试剂(一)仪器、用具：电转仪、电击杯、co2培养箱、35mm细胞培养平板、微量移液器、小试管、烧杯、量筒等。 (二)材料：呈指数生长的真核细胞hepg2，可以表达绿色荧光蛋白（gfp）的真核

3、表达质粒。(三)试剂：1)完全培养液（100ml）： dmem 90ml 胎牛血清 10ml2) 电转液：solution （10ml）：2g atp-disodium salt （atp-二钠盐）1.2g mgcl2 6h2o0.2um 滤器过滤除菌，-20保存。solution（500ml）：6g kh2po40.6g nahco30.2g 葡萄糖用naoh调节ph值到7.4。0.2um滤器过滤除菌，-20保存。使用前将80ul solution和4ml solution 混合，在4可以存放一个月。3）pbs 800ml水中溶解 8g nacl； 0.2g kcl； 1.44g na2hp

4、o4， 0.24g kh2po4，用浓hcl调ph值至7.4，定容1000ml，存于室温。4）青霉素、链霉素各一瓶。5）胰酶，工作浓度为0.1%，溶于pbs缓冲液中。四、方法与步骤1 在培养瓶中培养细胞，密度达到70%-80%融合。2 将电转液预热至室温。3 向35 mm孔板中加入2ml按比例混合的培养基与血清并置于37培养箱。4 取培养的细胞，弃去培养瓶中的培养基，胰酶消化后收集细胞。5 取细胞悬液进行细胞计数。6 取1106cell，200g离心10min，弃上清（尽量不要残留培养基）。7 用100ul电转液在试管内重悬细胞。8 向电转液中加入5ug质粒dna，轻轻混合均匀。9 将混合液移

5、至电击杯中。10 将电击杯置于电转仪中，选择程序t-28进行电转。11 电转结束后，立即将混合液取出并加入到事先准备好的6孔板中、置于37培养。12 24小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。五、注意事项1整个转染过程中需要保持无菌操作。2电转之前细胞最好传代4-5次，传代20次的hepg2不宜做电转。细胞密度达到70%-80%融合时宜做电转，密度太高会导致转染效率降低。3电转液重悬细胞以后的操作要尽量的迅速，要在15分钟内完成剩余操作，以减少电转液对细胞的伤害。六、作业观察荧光显微镜下成功转染的细胞，计算转染效率。七、思考参考文献阅读，考虑绿色荧光蛋白在生物学研究中的主要应用价值是什么

6、？附1：nucleofectorii细胞核转染仪简易使用方法及注意事项一、简易使用方法：1、查找所需的程序：在使用仪器前，必须先查找到转染的细胞所需要的程序及转染试剂盒的型号，具体操作如下：登陆网址/celldatabase/在这里找到自己的细胞名称，点击进入（注：需要注册），即可找到细胞所对应的程序（注：非96-well shuttle system，而是nucleofector），程序后的字母v、l、t、c、r即为所需的转染试剂盒型号。2、开机设置程序：打开桔黄色的主电源开关，等机器自检完毕并显示“free program choice”，按x键进入；如未显示，则重复按menu键直到出现“free program choice”，按go键进入。按 键选择设置程序的英文部分，按上下键选择对应的字母；按 键选择数字部分，上下键选择程序对应的数字，按x键确认程序。3、进行转染：在转染杯中加好样后放入仪器，点击x键，仪器自动进行电击转染。二、仪器使用注意事项：1、任何人等不得随意乱调仪器程序，影响大家使用；2、请爱护仪器，使用完毕后请及时清理仪器，擦拭干净，不得使用带腐蚀性的试剂接触仪器，切记用完后拔下仪器电源；3、使用该仪器时如果还有什么问题，请询问320室实验员侯敬尧；4、任何人在使用仪器前请先去320室进