第四章诱变剂

1、第四章第四章 诱变剂诱变剂 凡能诱发生物基因发生突变且突变率远远超过 自发突变率的物理因子和生物化学物质统称为诱 变剂。 包括： 物理诱变剂；化学诱变剂；生物诱变剂 诱变剂诱变剂 第一节第一节 物理诱变剂 第二节 化学诱变剂 第三节 生物诱变剂 主要内容主要内容 第一节第一节 物理诱变剂 物理诱变剂指物理辐射中的各种射线，包括紫外线、 x射线、射线、射线、快中子、射线、快中子、射线、射线、射线、微波、射线、微波、 超声波、电磁波、激光等。 诱变中常用的是紫外线（ uv）、x射线、 射线、 快中子。 物理辐射可分为电离辐射（ionizing radiation）、非 电离辐射（nonionizi

2、ng radiation ）。 单位：量子。 种类性质产生体波长效果 x射线 高能电磁波x 光机 0.06-136nm 产生正离子 射线高能电磁波钴、镭0.006-1.4nm产生正离子 快中子中子钚 -239撞出质子 紫外线光紫外灯136-390nm使内层电子级能提高 一、物理诱变剂的生物学效应一、物理诱变剂的生物学效应 物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射引起生 物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应 过程。 作用过程可分为物理、物理-化学、化学、生物学等几个阶 段。 辐射引起生物学效应的影响因素辐射引起生物学效应的影响因素 微生物的遗传背景 微生物的生理状态 可见光 水

3、分 温度 空气或氧气 二、非电离辐射二、非电离辐射紫外线紫外线 1.紫外线的诱变机制 形成嘧啶二聚体 2.DNA损伤修复 光修复 切补修复 （一）紫外线的诱变机制和 DNA损伤修复 （二）紫外线诱变 1、紫外线的有效光谱 能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是 200300nm，最有效的波长为253.7nm 。 2、紫外线的辐射剂量 有绝对剂量和相对剂量之分。 绝对剂量：单位erg/mm 2（1erg=10-7J）用剂量仪测 定 相对剂量：单位用照射时间或杀菌率表示。 剂量决定于紫外灯功率、灯管与照射物的距离及照射 时间。 15W紫外灯、30cm灯距、杀菌率9099.9时不同 微生物的照射时

4、间： 一般芽孢：10min 一般微生物营养体：35min 无芽孢菌和革兰氏阴性菌：0.52min 因此，某种微生物的最适剂量并不一定适合另一种。 3、紫外线诱变的步骤与方法 出发菌株 细菌：培养到对数期；霉菌、放线菌：孢子刚成熟。 前培养 制备营养丰富培养基 将菌体培养到最佳生理状态 制备菌悬液 离心 生理盐水悬浮，玻璃珠分散过滤 要求：分散度：90-95 菌体浓度：细菌：1108ml -1;放线菌107108ml-1 霉菌： 106107ml -1 方法： 紫外线照射 紫外灯预热将菌悬液放入平皿照射 后培养 稀释涂布 三、 电离辐射 1、电离辐射的种类、特征与来源 2、电离辐射剂量 、电离辐

5、射剂量 rad（拉德）：快中子的剂量单位。 1g被照射物 质吸收100 erg 辐射能量的射线剂量为 1rad。 R（伦琴）：x /射线的剂量单位。 1cm 3干燥空 气在0,1.01x10 5帕下产生2.08109离子对时 所需能量。 吸收剂量（符号为D）和吸收剂量率 适合于适合于射线、射线、射线、中子等任何电离辐射。射线、中子等任何电离辐射。 吸收剂量：指被照射物某一点上单位质量中所吸收的能 量值。 国际单位：戈瑞（Gy） 1kg被照射物吸收电离辐射的能量为1J（焦耳）时称为 1Gy。即：1Gy=1J/kg 。 原专用单位：rad（拉德） 1rad=10-2J/kg=10-2Gy 即： 1

6、Gy=100rad 吸收剂量率：是指单位时间内的吸收剂量。 单位：Gy/h Gy/min Gy/s rad/h rad/min rad/s 3、电离辐射的照射方法 直接对平皿上生长的菌落 进行照射。 用打孔器（6-10mm）将 菌落连同基质一同取出放于无 菌平皿内照射。 制成菌悬液，取1-2ml 置于试管内并浸入冰水中 进行短时间照射。 快中子：致死率为 50 85比较合适，采用剂比较合适，采用剂 量约为1530k rad。有利于正突变的产生。 X射线、 射线：杀菌率9099.9为宜。照为宜。照 射剂量为射剂量为1万20万万R。 四、近年来发展的新型诱变剂 1.微波：电磁波，分热效应和非热效应

7、。辐射中采用分散 低温干燥法消除微波热效应的影响。 2.红外射线：光谱的波长范围大于可见光小于无线电波的电 磁辐射区域的光波。 3.激光：是二十世纪六十年代发展起来的一种新光源。 可通过产生闪、热、压力和电磁场效应的综合作用，直 接或间接地影响生物活性。常见的是He-Ne激光。 4.高能电子流：是较强的电离辐射。 5.离子注入：是二十世纪八十年代兴起的一种新技术。利 用离子注入生物体引起遗传物质的改变，导致性状的变异， 从而达到育种的目的。突变率高。 6. 6. 航天育种：航天育种： 利用太空微重力、高能粒子、高真空、利用太空微重力、高能粒子、高真空、 缺氧和交变磁场等缺氧和交变磁场等 综合物

8、理诱变因子综合物理诱变因子 进进 行诱变和选择育种研究。行诱变和选择育种研究。 第二节第二节 化学诱变剂 化学诱变剂：凡是能改变DNA结构，并引起生物遗传变异 的化学物质。 种类：很多，在育种中常用的诱变剂包括四大类：碱基类似 物、烷化剂、移码诱变剂、其它。 特点： 1.作用机制：都是与DNA起化学反应，诱变效应与其理化性 质有关。 2.作用具专一性。 3.诱变剂量取决于浓度和处理时间。 4.绝大多数化学诱变剂都具有毒性，其中90以上是致癌物 质或极毒物质。 一、碱基类似物 定义：指一类和天然碱基分子结构类似的物质，既能诱 发正向突变，也能诱发回复突变的诱变剂。 掺入诱变剂 类别： 胸腺嘧啶类

9、似物：5-BrU；Brdu; 5-FU; 5-IU 腺嘌呤类似物：2-AP; 6-MP 1.诱变机制： 诱变机制： 2.碱基类似物的诱变处理方法 2.1 单独处理 2.2 与辐射线复合处理 接种培养到对数期离心饥饿培养8-10h 加入5-BrU，混匀 (终浓度：25-40ug/ml) 平板涂布培养 使之诱变 挑单菌落 筛选 二、烷化剂 1.定义：生物学上的烷化剂是指在正常的生理条件下， 能将其烷基转移给重要的生物大分子的一类化合物。 最早发现的烷化剂是氮芥子气。 2.烷化剂的种类：根据分子中烷基的数目多寡，可将烷 化剂分为单功能和双功能的烷化剂两大类。 已知广泛应用的有乙基璜酸乙脂(EES)、

10、甲基璜酸乙脂 (EMS)、硫酸二乙脂(DES) 、亚硝基胍(NTG)，等。它们 有着良好的诱变效应。 3. 烷化剂的作用机制烷化剂的作用机制 烷化剂主要是通过烷化基 团使使DNA分子上的碱基 及磷酸部分被烷化， DNA复制时导致碱基配 对错误而引起突变。 碱基中容易发生烷化的位 点。 G-N 7 、G-O 6 、T-O 4 。 3.1 作用位点作用位点 （1）对碱基的烷化作用 3.2 作用方式 （2）引起DNA双链间的交联 4. 烷化剂的性质烷化剂的性质 烷化剂的性质比较活泼，在水溶液中容易发生水解。它们 大部分半衰期很短（与温度、溶液pH关系很大）。 烷化剂杀菌率低而诱变效应高；极毒！能致癌

11、。 操作中应有防护措施，且小心谨慎！避免接触身体及 污染环境。 5.几种常用烷化剂 几种常用烷化剂 5.1 亚硝基胍（全称：1-甲基-3硝基-1-亚硝基胍 NTG） 性质： 黄色结晶，不溶于水，见光易分解。 有超诱变剂之称。能使细胞发生一次或多次突 变。还能使多基因并发突变。 诱变适合pH值为6.0。 诱变处理方法： 菌体用缓冲液洗下制成菌悬液，离心，洗涤（浓度 10 6 10 7 ml -1 ） 配制NTG母液：配成1mg/ml（比例：NTG丙酮溶液 1ml: 缓冲液9ml）。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml。 诱变处理：参考菌种和终浓度要求，将NTG加入菌悬液， 保温一定时间（细

12、菌2060min）。 终止反应：用冷生理盐水稀释50倍以上。 后处理：低温离心洗涤除去药液，加无菌水悬浮并做成 一定稀释度分离于平皿。或按一定浓度加后培养基于菌体 沉淀物中，振荡培养1.52h再稀释分离。 凡接触NTG的器皿必须及时、单独处理。 5.2 甲基璜酸乙脂（又称乙基硫酸甲烷 EMS） 性质：无色液体难溶于水，不稳定，易水解挥发。 最佳诱变pH:7.07.4 诱变处理方法: 配制 0.5mol/L EMS 母液：预冷所需器皿，取10mol/L EMS原液0.5ml 加入9.5ml pH 7.2 的磷酸缓冲液中，加盖封口。 制备菌悬液：培养菌体至对数期，离心洗涤，用缓冲液制 成 8ml

13、菌悬液（10 7 10 8 ml -1 ；孢子为10 6 10 7 ml -1 ）。 诱变：取EMS母液 2ml 加入以上 8ml 菌悬液中（终浓度 为 0.1 mol/L ；孢子为 0.2 0.5 mol/L），处理一定时间（根 据预实验结果确定）。 终止反应：用 50 倍生理盐水稀释或加入2Na 2 S 2 O3，多次 离心洗涤。 5.3 硫酸二乙脂 （DES） 性质：无色液体，不溶于水，很不稳定。最佳诱变 pH 7.2 诱变处理方法： 2母液配制：取DES原液0.4ml 于灭菌试管中，加入少 许乙醇使溶解，再加入 pH 7.2 磷酸缓冲液 19.6 ml 。 菌悬液制备：用同一缓冲液将菌

14、体洗下。 诱变处理：取以上DES溶液和菌悬液等量混合一定温度 下，振荡培养2060min。 终止反应：加入生理盐水稀释，或加入2 Na 2 S 2 O3 0.5ml 终止反应。 后处理：将 20ml 肉汤培养基加入菌体沉淀物中，培养 1.5 2h，然后稀释分离。 三、脱氨剂（亚硝酸）三、脱氨剂（亚硝酸） 1.诱变机制： 诱变机制： 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的 DNA 分子，分子， 氧化碱基中的氨基成酮基，引起转换。还可引起，引起转换。还可引起 DNA 双链间的交联。双链间的交联。 2.诱变处理方法： 诱变处理方法： 试剂配制： 处理过程： 终止反应

15、： 后处理： 四、移码诱变剂 1. 诱变机制：与DNA结合引起碱基增加或缺失而造成突 变。主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素（2 , 8 二氨基 吖啶）等。 3. 诱变处理方法：先用乙醇配成一定浓度的母液，然后 加入培养基中，使最后浓度为1015 ug/ml ，混合后制 成平板，将处理菌悬液接种其上，适温下培养。 2. 性质：淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇、乙醚， 见光易分解。 五、 羟化剂（羟胺） 1. 诱变机制：具有特异性，专一地诱发G:C A:T的转 换。 2. 诱变处理方法：将羟胺加入培养基中，使浓度为0.1 0.5 ，然后接入菌体，适温下培养12h。 性质：白色晶体，溶于水，不稳定易分解，易吸潮。 六、金属盐类六、金属盐类 七、其它 主要有氯化锂、硫酸锰等。一般作为助诱