谷胱甘肽作为脂质过氧化损伤指标的研究.

1、谷胱甘肽作为脂质过氧化损伤指标的研究谷胱甘肽（GSH是广泛存在于细胞内的小分子三肽化合物，它参与细胞内氨 基酸转运、糖代谢和DNA合成调节，在拮抗外源性毒物、氧自由基损伤、调节 机体免疫功能、维持细胞蛋白质结构和功能、抑制细胞凋亡等方面发挥着重要 作用10多年来，人们试图根据 GSH被氧化还原的程度来评估氧自由基脂质 过氧化损伤，并取得了不少进展。、谷胱甘肽的一般生理特性GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，是细胞内呈液态、含巯基最为丰 富的一类化合物，半胱氨酸 a氨基上的-SH为该分子化合物活性中心。GSH在 不同脏器浓度不同，以肝内最高，依次为脾、肾、肺、脑、心、胰和骨髓，血 液中浓度最低

2、 2；同一器官不同部位浓度相差亦较大，而同一细胞内不同细 胞器间GSH含量亦不一致。谷胱甘肽氧化型（GSSG为GSH的氧化形式，在氧化剂作用下 GSH通过GSH- 过氧化物酶（GSH-PX氧化成GSSG后者通过NADP供氢，在谷胱甘肽还原酶 （GSH-RX作用下又还原成GSH二者构成一动态平衡，使 GSSGt持在总GSH 量的1%10%水平3,构成一有效的抗氧化系统。生理状态下，GSH/GSSG维持在高比率，而在氧化应激时， GSHK化成GSSG GSH/GSS比率下降，故可 借以评估脂质过氧化损伤情况。GSH合成主要在肝内，其合成除与半胱氨酸及 NADP含量有关外，其合成 限速酶谷胱甘肽合成

3、酶（GCS亦有重要作用。GCS有 2个亚基GCLR和GCLS 以GCLF为主，GCLS起调节作用。在氧化状态，GCLR勺mRN高表达且有剂量依 赖性，而低水平GSH对GCLR勺mRN彫响则不明显；相反，抑制 GSH-Rx后, GCLR勺mRNAU高表达，提示GSSG寸GCLF有调节作用，并进而反馈性调节 GSH 水平4o GSH青除主要在肾脏，占血循环总量 50%65%，双肾动脉中 80%的GSHffi GSSG?一次肾循环后被滤过，但可经 Na+-依赖性GSH转运系 统重吸收。、GSF拮抗自由基脂质过氧化损伤机理GSH在拮抗氧化性毒物中发挥重要作用，一方面可与毒物分子及其代谢物 发生结合反应

4、降低毒物毒性；另一方面可通过氧化还原反应而降低毒物过氧化 的能力，使含巯基酶免于被重金属和氧化剂激活或使已氧化的含巯基酶还原而 使其恢复活性。在自由基大量产生时，细胞膜不饱合脂肪酸氧化成脂过氧基，并引起一系 列继发损伤。GSH可直接通过供H+拮抗氧自由基毒性，终止连锁反应，其本身 则被氧化成GSSG同样，GSH在对抗氧自由基过氧化并抑制由此引发的细胞凋 亡、坏死及自稳态改变等方面亦发挥着重要作用。GSH/GSS体内代谢有多种途径，在氧化状态下，GSHH方面被氧化成GSSG表现为相应GSH/GSS的降升；另一方面，GSH与外源毒物及其代谢物发 生结合反应，最终生成硫醇脲酸经尿排出，此时仅为相应G

5、SHT降，而GSSGE化可能并不大，甚或因GSH肖耗而GSSG降低5。GSSGfe可被还原成GSH 外，还可通过GST（谷胱甘肽-S-转移酶）发生结合反应。、体内影响GSH水平因素由于血中GSHi要源于肝脏等器官，所以血浆 GSH水平无疑是间接反映有 关器官，如肝、肾内GSH水平的较理想指标。目前测定仍多停留在动物实验阶 段，有关人血GSH浓度报道较少，近期报道人血浓度为 1.000 0.167（715例） 1。在许多病理情况下，如糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、外源性毒物致过氧 化时，GSH水平下降。近期又发现艾滋病、帕金森病、衰老及低氧血症病人的 GSH也下降，并发现老年人伴GSH氐下者的身体

6、健康状况较高GSH者差。Hagg等报道，在生理状态下男性 GSH水平高于女性，素食者高于非素食 者，老年人GSH明显下降，黑人GSH高于白种人1, 60另外人们还发现， GSH水平与体育活动程度及营养有关。有趣的是，吸烟者GSH高于非吸烟者,这可能是机体对长期吸烟引起慢性氧化状态的适应性调节反应，这也进一步提 示，GSH在体内抗氧化过程中的重要作用。四、不同化学毒物诱导的脂质过氧化状态下GSH/GSS的变化体外试验显示，当细胞暴露于亚毒性浓度毒物时，GSH并不下降而是升高。 Cookson 等7用神经胶质细胞分别与亚毒性浓度三甲基锡、三乙基锡 共同培养24小时，细胞内GSH1著升高；Ochi

7、8用中国仓鼠V79细胞与亚 毒性浓度砷共同孵育时，发现在 8小时GSH升高最大，之后降低；另外，亦有大量试验显示暴露于亚毒性浓度的铅、汞、甲基汞等化合物亦使GSH升高9,提示可能是细胞在应激时采取的一种保护性机制，与长期吸烟致GSH升高情况类似。Palmeira 等10将雄性 Wistar 大鼠肝细胞分别和不同毒性浓度的除莠 剂百草枯和2,4-D共同进行体外培养，用Hissin酶化学法检测GSH/GSS。结 果显示，GSH浓度随接触时间而降低，孵育 23小时降至最低水平，且存在剂 量-反应关系，而GSSGU呈正比升高。Lora等用雄性Fischer344大鼠与不同 浓度的双氯乙基亚硝脲一起孵育

8、并采用反相高效液相色谱(HPLC法检测 GSH/GSS水平，亦得出同样结论11。而在体内实验，情况则复杂得多。 Stone 等12以不同浓度的维生素K3(0、30、60和100卩mol/L)对鼠染毒，用 Hissin-Hilf酶化学法分别测定GSH/GSS，结果显示GSH降低及GSS毋高具有剂量依赖关系，但GSHF降与 GSSG高不成等比例，当 GSH值(卩mol/g)由1.45 0.28降到0.57 0.07时 (61 %)，GSSGt时升高仅为GSH丢失的10%。有研究用甲醇(3.0和6.0 g/kg) 对雄性大鼠染毒，并分别于不同时间测其肝细胞、红细胞及血浆GSH/GSS，结果显示3.0

9、 g/kg 组GSH 12小时达最低，从4.4卩mol/g降至3.4卩mol/g(PV 0.05)，其后缓慢恢复，GSH-Px GSH-RX舌性与GSH亦同步升降，但GSSGS 化则不明显，这可能是由于 GSH与新生成的甲醛直接结合而未生成 GSSG13。另有实验则显示由于 GSH与毒物结合，GSSG成也减少，GSH/GSS比 率反较前升高 5， 13。有些实验显示，外周血GSSGE化较GSH敏感，这可能与细胞受损后 GSH GSSGI放到细胞外水平不同有关。Navarro等14对成年OF1小鼠给予17 Gy的高能X线照射，并在不同时间测其血中 GSH/GSSG此外，对患乳腺癌及肺 癌病人在接

10、受不同剂量放射治疗时亦采用 HPLC法测定上述指标，结果显示小鼠 血中GSH浓度变化不显著，GSSG高，GSH/GSS下降，并与放射剂量有剂量和 时间依赖性，尤以2小时GSS高最显著；鼠肝、心、胰腺中变化亦明显， 且同时有GSHF降并有统计学意义；肿瘤放疗病人结果亦显示外周血GSSGK平则随放疗累积量增加而升高，并有显著统计学意义，而GSH变化则不显著。但在以该指标评估脂质过氧化损伤时，尚需注意到GSH/GSS系统的参与情况。Lii等15采用雄性SD大鼠，分别予以百草枯(20和40 g/kg)、敌草快 (85和190 mg/kg)染毒，结果见肝细胞 GSHffi GSSG其比率变化均无统计学

11、意义，而此时通过检测氧自由基脂质过氧化产物硫巴比土酸反应物，则显示肝 细胞有较严重氧自由基脂质过氧化损伤，这可能与蛋白质-S-谷胱甘肽化有关，GSH/GSS(系统则可能未参与上述过程。以GSH/GSS作为指标评估脂质过氧化损伤，诸多实验结果有不小差异，可 能与以下因素有关：1 测量方法：检测GSH/GSS方法有多种，归纳起来主要有2类：酶化学 法和HPLC法。前者主要根据GSH在氧化还原过程中酶代谢动力学改变，如利用 GSH被二硫代对二硝基苯氧化，生成硫硝基苯酸盐的程度，间接反应GSH/GSSG的水平。HPLC法则可据实验波谱直接测定 GSH/GSSG敏感性、专一性较高，但 操作复杂。两种方法的结果多数一致 1， 15，而 Floreani 等16则认为 HPLC较化学法 敏感10倍以上，两方法所测结果有显著差别，但都面临同样问 题，女口 GSH/GSS在细胞内隔窒化(compar