赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计专业技术方案

1、赤芍总昔的提取纯化与质量检查设计方案1文献背景赤芍为毛萇科植物芍药Pae onia lactiflora Pall.或川赤芍Pae onia veitchii Lynch 的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分为芍药昔、芍药 内酯昔、氧化芍药昔、苯屮酰芍药昔、芍药花昔等单祜昔类化合物，总称赤芍 总昔，可改善机体微循环，抑制血小板凝聚，抗血栓形成，具有广泛的药理活 性3,是一种可用于保健食品的中药。1.1赤芍总昔背景意义在药理学上，赤芍总昔对血液具有抗凝血、抗血栓以及抗内毒素和改善微循 环的作用。并且赤芍总昔对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用【4】，正是 这样的良好使用疗效，

2、我们需要对赤芍总昔进行更多的研究，来保证临床的使 用疗效。1.2提取研究现状LI前报道的赤芍总昔提取工艺文献中，多采用正交实验设计法问。即分别 称取赤芍药材若干（通常800g）,以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交实 验设计表实验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交实验各实验的提取液。 1.3纯化研究现状訂前报道的赤芍总昔纯化工艺文献中，多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸 附法【叭 即将提取过程中，包括糖类、脂类等许多杂质在内的浸膏提取液，补 充蒸憎水至药材的2倍量，作为待纯化样品溶液。纯化方法1 （正丁醇萃取法）：取上述待纯化样品溶液200ml,取等量石油 瞇萃取3次，除去石油醯层，然后用水饱和

3、后的正丁醇萃取3次，收集正丁醇 层，再用200ml蒸镭水洗1次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空 干燥器中干燥。纯化方法2 （大孔树脂吸附法）：D101大孔吸附树脂100g,经95%乙醇浸 泡12h,充分溶胀后装柱，蒸憎水洗至无醇味，备用。上述待纯化样品溶液取 200ml,上树脂柱，3倍量蒸憾水洗，再用3倍量的乙醇洗脱，收集20%洗脱组 分，减压回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。1.4质量控制赤芍中赤芍总昔质量控制包括性状鉴别（颜色、气味）、薄层鉴别（蓝紫色 斑点）、以及对其进行高效液相色谱的含量测定（检测波长为230nm,理论板 数按芍药昔峰汁算应不低于3000）以及水分、炽灼残

4、渣，重金属等检测。2赤芍饮片的质量检査2.1性状：本品应呈圆柱形，稍弯。表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须 根痕和横长的皮乳样突起，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色 或粉红色，有的有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。2.2鉴别：取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣 加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药昔对照品，加乙醇制成每1ml 含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录VIB）实验，吸取上述 两种溶液各4卩1,分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-中醇- 甲酸（40： 5： 10： 0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以

5、5%香草醛硫酸溶 液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显 相同的蓝紫色斑点。23含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。2.3.1色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以屮醇-0.05moI/L磷酸二氢钾溶液 （40： 65）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药昔峰计算应不低于 3000o 2.3.2对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药昔对照品适量，精密称 定，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液,即得。233供试品溶液的制备取本品粗粉约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入屮醇25ml,称 定重量

6、，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用屮醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.3.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10卩1,注入液相色谱仪，测定， 即得。本品含芍药昔（C23H28O11）不得少于1.8%参考文献：2015版中国药典3赤芍总昔的提取工艺3.1指标成分的选择及含量测定赤芍中所含丰富的昔类成分总称赤芍总昔，为赤芍的主要活性部位，其中 以芍药昔的含量最高，选择芍药昔作为含量测定的指标成分。3.1.1 HPLC色谱条件的优化选择色谱柱的选择:考察 Hypersil ODS( 150mm*4.6mm,5jim)和 HypersilBDS(200mm

7、*4.6mm,5 屮 n)流动相选择：流动相考察中醇-水系统、甲醇-0.05%磷酸溶液系统、乙睛-水 及乙0-0.05%磷酸溶液系统。流速选择：流速考察 0.6ml/min 0.8mmin、1 .OmI/min3.1.2对照品溶液的制备精密称取芍药昔对照品10.63mg,置25ml量瓶中，加中醇溶解并稀释至刻 度，摇匀，即得对照品贮备液(每1ml含芍药昔对照品425.2pg) o3.1.3标准曲线的制备分别精密量取对照品贮备液溶液(425.2pg/ml)0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、 4.0mk 5.0ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述不同 浓度对照

8、品溶液各10卩1注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。 以对照品浓度X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线。3.4供试品溶液的制备及测定取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。分别精密吸取对照 品溶液与供试品溶液各10卩1,注入液相色谱仪，测定，山外标一点法计算即得 芍药昔含量。3.2提取溶媒的筛选：赤芍中所含昔类成分极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。 本实验以芍药昔的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药昔的提取 效率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒。见表1：表1不同提取溶媒芍药甘含量提取溶媒水50%乙醇70%乙醇溶媒用量（倍）666提取次数（次）2

9、22提取时间（h）1.51. 51.5芍药昔含量（）33正交实验设计优化提取工艺3.3.1因素水平设置溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为3个考察因素，因素 水平设置见表2。表2因素-水平表因素-水平A提取洛媒（倍）B提取时间（h）C提取次数（次）1411261.5238233.3.2实验安排及结果考察影响提取效能的主要因素乙醇用量、提取时间、提取次数及相应水 平，选取正交表LX34）作正交实验，所选因素一水平见表2。称取川赤芍药材约 50g,按5（34）正交实验表按排实验，以芍药昔含量（芍药昔含量二提取液中芍药 昔

10、质量/称取的药材量*100%）为评价指标。实验方案见表3表3 3L9(34)正交实验表表头ABCD芍药昔含疑(%)列号1234111112122231333421235223162312731328321393321IIIIIISS333验证实验以优化工艺条件重复实验3次，验证实验结果见表4表4验证实验结果实验实验号投料量固形物固形物 RSD芍药苜芍药昔RSD方案(kg) 得率 平均得率含量 平均含量(%) (%) (%) (%) (%) (%)234赤芍总昔(TPG)的纯化工艺的优化4.1上样液预处理赤芍醇提液减压浓缩至无醇味，加水适量分散溶解、过滤定容，制成每毫 升含0.2g生药（0.2g

11、ml）的溶液，备用。4.2大孔吸附树脂型号筛选取AB-8型和D-101型大孔吸附树脂各20ml,装于树脂柱中（径高比为 1:8）,取样液40ml上样。先用3BV蒸谓水，再用5BV 20%乙醇洗脱，合并乙 醇洗脱液，测定，结果见表5o从芍药昔吸附解读率和残液中芍药昔含量综合 考虑，选择树脂种类。表5树脂动态吸附实验结果树脂型号上样液含量吸附解吸率残液中含量(mg)(%)(%)D101207.31AB-8207.314.3上样浓度考察取AB-8型大孔吸附树脂3份，每份20ml,装柱（径高比为1:8）,分别取含 生药浓度为O.lg ml 0.2g ml、0.3g ml1样品液上样,吸附流速为 1.0

12、ml min1-然后用3BV水洗脱，再以5BV 20%乙醇洗脱，按4.3色谱条件 进行测定醇洗脱液中芍药昔含量，结果见表6。表6上样浓度考察结果上样浓度（g ml1）0.10.20.3芍药昔洗脱量（mg）洗脱率（）4.4泄漏曲线考察取AB-8型大孔吸附树脂20ml,装于树脂柱中（径高比1:8）,取样品液60ml 上样，吸附流速为1.0ml min *o收集流出液,每5ml为一流分。按如下色谱 条件测定，绘制泄漏曲线，确定最大上样量。色谱条件:Diamonsil C18色谱柱（250mmx 4.6mm,5pm）；乙月青为流动相A, 水为流动相B,按表7进行梯度洗脱；流速1.0ml-mm1；柱温2

13、5C；检测波长 230nnio表7流动相梯度洗脱时间表时间/min流动相A/%流动相B/%01486209552514864.5吸附流速的考察取AB-8型大孔吸附树脂3份，每份20ml,装柱（径高比为1:8）,取样液 60ml 上样，吸附流速分别为 1.0ml min、2.0ml min、3.0ml min。进行 动态吸附后，先用3BV水洗脱，再用5BV 20%乙醇洗脱，按4.3色谱条件进行 测定，结果见表8表8吸附流速考察结果吸附流速（ml min1）123芍药昔洗脱量（mg）洗脱率（）4.6树脂径高比考察取直径依次为1.4cm. 1.5cm、1.6cm的树脂柱3根，分别加入AB-8型大孔

14、吸附树脂各20ml,装柱（径高比为1:6、1:8、1:10）,取样液60ml上样，吸附流 速为1.0ml min-L然后用3BV水洗脱，再以5BV 20%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，按4.3色谱条件进行测定，结果见表9。表9树脂径高比考察结果树脂径高比1:61:81:10芍药昔洗脱量（mg）洗脱率（）4.7水洗除杂体积考察取AB-8型大孔吸附树脂四份，每份20ml,装柱（径高比1:8）,取样品液 60ml上样，吸附流速分别为1.0ml miL,进行动态吸附后，分别用1BV、 2BV、3BV和4BV水洗，测定水洗脱液中芍药昔的含量，计算损失率，结果见 表10o表10水洗除杂体积考察结果水洗脱体积（

15、BV）1234水洗液中芍药昔累积含量（mg）芍药昔累积损失率（）4.8洗脱溶剂考察取AB-8型大孔吸附树脂4份，每份20ml,装于树脂柱中（径高比为1 ：8）, 60ml样品液上样，吸附流速分别为1.0mlmin。然后先以3BV水洗脱,再分别用20%、40%、60%和80%乙醇洗脱，按4.3色谱条件进行测定醇洗脱液 中芍药昔含量，结果见表11。表11洗脱溶剂考察结果洗脱剂乙醇（）20406080芍药昔洗脱量（mg）洗脱率（）4.9洗脱曲线取AB-8型大孔吸附树脂20ml,装于树脂柱中（径高比为1:8）, 60ml样品液 上样，吸附流速分别为1.0mlmi。然后先以3BV水洗脱，再用20%乙醇洗

16、 脱，每10ml收集一份，洗脱液减压至干，以10ml中醇复溶，按4.3色谱条件 进行测定醇洗脱液中芍药昔含量，绘制洗脱曲线，确定洗脱剂用量。5赤芍中赤芍昔提取物的质量控制5.1性状：棕褐色粉末，气微香，味微苦、酸涩。5.2鉴别：取本品粉末0.2g,加乙醇10ml,振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残 渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药昔对照品，加乙醇制成每 lml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）实验，吸取 上述两种溶液各4卩1,分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯屮烷-乙酸乙酯-屮 醇-甲酸（40： 5： 10： 0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草

17、醛硫 酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置 上，显相同的蓝紫色斑点。53含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定。5.3.1色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以屮醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液 （40:65）为流动相；检测波长为230nmo理论板数按芍药昔峰计算应不低于 3000o5.3.2对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药昔对照品适量，精密称 定，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液,即得。5.3.3供试品溶液的制备取本品粉末约0.2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入屮醇25ml,称 定重量，浸泡4小时，超声处理2

18、0分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。5.3.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10Rl,注入液相色谱仪，测定， 即得。将提取物中芍药昔含量换算成药材中芍药昔含量，对比药典，检查提取 纯化工艺是否合适。2015版中国药典中规定赤芍药材中含芍药昔（C23H28O）不得少于1.8%。5.3.5系统适用性实验线性关系考察 吸取上述对照品溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml,分别 置25ml量瓶内，加屮醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10小注入液相色谱 仪分析。以进样量（聘）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线 性回

19、归，结果见表12：表12线性关系考察结果芍药昔对照品（ug）12345精密度实验精密量取已知浓度的芍药昔对照品溶液10pl,按液相色谱条件, 进样测定6次，结果见表13：表13精密度实验结果 峰而积值wffi123456稳定性实验取本品，制备供试品溶液，测定芍药昔于0、2、4、6、8. 10小时内峰面积，结果见表14：表14稳定性实验结果时间（小时）峰面积值平均峰而积值RSD（%）0246810重复性实验 取本品，一式6份，制备供试品洛液，测定样品中芍药昔含量,结果见表15：表15重复性实验结果样品量（g）芍药昔含量平均含疑RSD?%）（nig/g）（mg/g）3456加样回收率实验取已知含量

20、芍药昔的本品6份，每份约10mg,精密称定，分 别按样品中芍药昔含量精密加入芍药昔对照品，按供试品溶液制备方法制得供 试品溶液，精密量取续滤液10pl,经HPLC分析，测定芍药昔含量，计算回收 率，结果见表16：表16加样回收率实验结果取样量样品中芍芍药昔对芍药昔测回收率平均回收RSD(%)(g)药昔量照品加入得疑(%)率(mg)M( mg)(mg)5.4水分按中国药典2013年版四部通则0832的第二法项下操作，取本品粉末 约1呂，平铺于恒重的扁形称量瓶中，厚度5mm,精密称定，打开瓶盖100 105C,烘5小时，盖好，移至干燥器中冷却30分钟，精密称定，同样温度下 在烘1小时移至干燥器中冷却30分钟，精密称定。直至连续两次称定重量之差 5mg为止。按减失重量和称样量计算供试样品中水分含量()见表17。表17水分含量样品编号水分含量/%平均含量/%123按中国药典2015年版四部通则0841进行炽灼残渣的检测，取本品粉末约lg,置已炽灼至恒重的坷竭中，精密称定，缓缓织灼至完全炭化，放冷至室 温；加硫酸0.5ml使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽后，在500600C炽灼使 完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500600C炽灼至 恒重。表18炽灼残渣样品编号炽灼残渣/%平均值/