血浆DNA定量检测的标准化操作流程资料

1、血浆DNA定量检测的标准化操作流程 南京医科大学第一附属医院临床检验中心 2007年12月第1版 血浆DNA定量检测的标准化操作流程 1. 血液样本的采集： （1） EDTA-K2抗凝真空采血管（无分离胶）采集外 周静脉血23 ml，充分颠倒混匀，记录采集时间 EDTA-K2抗凝真空采血管（有分离胶）采集外 周静脉血23 ml，充分颠倒混匀，记录采集时间 2. 血液样本的处理：分离血浆 步骤1-（1）的抗凝血经3 000 rpm低速离心10 min 后，吸取上层血浆，再经16 000 g高速离心10 min后，吸取上层血浆200 M，加入到“血浆DNA 定量样品管”中（含50 000 copi

2、es质粒DNA内 参照）,余血浆样本-20 C及以下冻存。无法立即 处理，见步骤3。 （2）步骤1-（2）的抗凝血经3 000 rpm低速离心10 min 后，吸取上层血浆 200讪，加入到“血浆 DNA 定量样品管”中（含50 000 copies质粒DNA内 参照）,余血浆样本-20 C及以下冻存。 （3）血液样本采集后若无法立即处理，需详细记录采 集时间，4 C或室温保存（48h内必须分离血浆）； 密闭阴凉常温下运输（48h内必须完成运输并分 离血浆）。 3. 血浆样本的处理：核酸的提取和纯化 采用磁珠法提取步骤2-(1)和2-(2)的200讪血浆 样本中的微量DNA。具体操作如下： 在

3、“血浆DNA定量样品管”中加入200 I巖解液1和4 d蛋白酶，与待测血浆充分混匀后放55 C水浴15 min ; 将离心管取出后每管加入 600 d磁珠/结合液的混合液， 振荡混匀，室温放置10 min，中间颠倒混匀一次； 将离心管侧靠在磁珠分离操作台的磁体上，放置4 min, 吸弃液体，注意不要碰或吸走红色沉淀，将离心管拿离磁体； 在离心管内加入200 I d洗液3,将红色沉淀振荡，充分混 匀，然后将离心管侧靠在磁体上，放置 1 min，吸弃液体，将离 心管拿离磁体； 在离心管内加入100 I d洗液4,将红色沉淀振荡，充分混 匀后，将离心管侧靠在磁体上，放置 1 min，吸弃液体，将离心

4、 管拿离磁体； 离心管放在55C烤箱中干燥10 min ； 在干燥后的离心管内加入 40 d洗脱液5,充分溶解红色 沉淀，在55 C烤箱中保温10 min，离心管侧靠在磁体上，放置 1 min，将液体取出放入干净的无菌离心管内，即为DNA提取液。 (2)血液样本分离后得到的血浆若无法立即处理，需 详细记录分离时间，-20 C及以下冻存，冰冻运 输(48h内必须完成运输并进行核酸提取)。 4. 双重荧光定量PCR : (1) 双重荧光定量PCR反应体系，包括：去离子水、 缓冲液、dNTPs、MgCl2、引物1、引物2、引物 3、探针1、探针2、热启动DNA聚合酶和DNA 模板。反应条件为：95

5、C预变性5min ; 94 C 30s , 55 C 30s , 72 C 40s 共 45 个循环，每 次循环结束前采集一次荧光信号。 (2) 提取的核酸样本若无法立即检测，需详细记录提 取时间，-70 C及以下冻存(48 h内必须进行检 测)。 5. 数据分析和计算： 根据扩增曲线的情况，设定基线和阈值，获得各 样本的荧光信号数据和Ct值。 采用LinRegPCR软件，根据荧光信号数据，获得 各样本扩增效率，并分别计算内参照物和目的基因的 平均扩增效率Ep和Eb。 根据公式 Cb=Cp (1+Ep)Ctp (1+Eb)Ctb 计算各样本的血浆 DNA 浓度(copies/ml)，其中，Cp

6、=250 000 copies/ml。 再根据1copy人基因组DNA为3.3pg，将所得的结果 (copies/ml)换算为血浆 DNA 浓度(ng/ml)。 6. 室内质量控制： (1) 按照步骤1-(1)收集数名健康体检者抗凝静脉 血，经3 000 rpm低速离心10 min后，吸取上层 血浆，再经16 000 g高速离心10 min,吸取上层 血浆，获得混合血浆约2 ml，作为质控品血浆。 (2) 取200讪质控品血浆，加入到“血浆 DNA定量 样品管”中(含50 000 copies质粒DNA内参照 干粉)。余步骤参照步骤3、4、5。 (3) 重复步骤6-(2)共20次，计算质控品血浆DNA 浓度的平均值(M)和标准差(SD)，以M 2SD作 为血浆DNA定量检测的质量控制范围。 (4) 每次临床样本的检测，从步骤3开始，质控品血 浆都伴随进行。当质控品血浆 DNA浓度在M 土 2SD范围内，此次定量结果可信；当质控品血浆 DNA浓度在M 2SD范围外，此次定量结果不 可信，重复步骤3、4、5。 (5) 每10次在M 2SD范围内的质控品